摘 要：本发明公开了涝害胁迫下工业大麻不同组织的内参基因及其应用，所述内参基因包括ScActin2、ScTATA和ScTIP41三种基因。本发明的稳定内参基因可作为工业大麻涝害胁迫下功能基因表达分析的可靠参照，为后续耐涝相关功能基因的挖掘、信号通路解析等研究提供关键技术支撑，推动工业大麻抗逆分子育种研究。
权利要求书
1.涝害胁迫下工业大麻不同组织的内参基因，其包括ScActin2、ScTATA和ScTIP41三种基因。
2.权利要求1所述的内参基因作为工业大麻涝害胁迫下功能基因表达分析的参照。
3.根据权利要求2所述的应用，所述ScActin2作为根的内参基因。
4.根据权利要求2所述的应用，所述ScTATA作为茎和叶的内参基因。
5.根据权利要求2所述的应用，所述ScTIP41作为根、茎、叶的内参基因。
6.根据权利要求2所述的应用，所述功能基因表达分析是通过实时荧光定量qRT-PCR进行。
7.根据权利要求6所述的应用，内参基因ScActin2的实时荧光定量qRT-PCR扩增引物是：
F:ATGAATGCCGATACGCTGTT；
R:TTGAACCTGTCCTTGGAGC。
8.根据权利要求6所述的应用，内参基因ScTATA的实时荧光定量qRT-PCR扩增引物是：
F:CTGAAGTAAGGGTATCGTC；
R:TTCTGTAATGTTGGGACTA。
9.根据权利要求6所述的应用，内参基因ScTIP41的实时荧光定量qRT-PCR扩增引物是：
F:TCTGATTCTGCTGCTTACA；
R:TAGAGGTTACCAGGGACTT。
技术领域
本发明属于植物分子生物学领域，特别是涉及涝害胁迫下工业大麻不同组织的内参基因及其应用。
背景技术
工业大麻（Cannabis sativaL.）作为一种兼具经济价值与生态价值的作物，其纤维可用于纺织、建筑领域，籽实可加工为食品与油脂。然而，工业大麻生长周期中易遭遇涝害胁迫，破坏根系细胞结构、抑制光合作用、扰乱物质代谢，导致植株生长受阻、产量锐减甚至死亡，严重制约其规模化种植与产业发展。
基因表达分析是解析植物响应逆境胁迫分子机制的核心手段，其中实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）因特异性强、灵敏度高、重复性好的优势，被广泛用于检测目标基因的表达水平。但qRT-PCR结果的准确性高度依赖内参基因的稳定性——内参基因需在不同实验条件（如胁迫处理）、不同组织器官、不同品种中保持恒定表达，才能作为校准目标基因表达量的“基准”，抵消RNA提取效率、反转录效率及PCR反应体系差异带来的误差。
目前，植物逆境胁迫相关研究中，常用的内参基因多为传统持家基因，如编码肌动蛋白（ACT）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、18S核糖体RNA（18SrRNA）的基因等。这些基因虽在部分植物或特定胁迫下表现出一定稳定性，但“稳定性”具有显著的物种特异性、组织特异性与胁迫条件特异性——例如，在拟南芥干旱胁迫中稳定表达的ACT基因，在水稻涝害胁迫下表达波动显著；同一基因在工业大麻叶片中表达稳定，在根系中却可能因胁迫响应而表达量剧烈变化。针对工业大麻涝害胁迫的分子机制研究仍处于起步阶段，尚未有研究系统筛选并验证在涝害胁迫下工业大麻不同组织（如根、茎、叶）中均能稳定表达的内参基因。现有研究多直接借用其他植物的内参基因，或选用未经涝害胁迫验证的工业大麻持家基因，导致qRT-PCR检测的目标基因表达量准确性存疑，进而干扰对工业大麻涝害响应关键基因的筛选、功能解析及分子育种工作的推进。
因此，亟需建立一套科学的筛选体系，从工业大麻候选基因中筛选出在涝害胁迫条件下和不同组织中表达稳定性高的内参基因，为精准解析工业大麻涝害响应分子机制、培育耐涝工业大麻品种提供可靠的技术支撑。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
本发明涉及涝害胁迫下工业大麻不同组织的内参基因，其包括ScActin2、ScTATA和ScTIP41。
本发明另一方面还涉及上述内参基因作为工业大麻涝害胁迫下功能基因表达分
析的参照。
在本发明的一个优选实施方式中，所述ScActin2作为根的内参基因。
在本发明的一个优选实施方式中，所述ScTATA作为茎和叶的内参基因。
在本发明的一个优选实施方式中，所述ScTIP41作为根、茎、叶的内参基因。
在本发明的一个优选实施方式中，所述功能基因表达分析是通过实时荧光定量qRT-PCR进行。
在本发明的一个优选实施方式中，内参基因ScActin2的实时荧光定量qRT-PCR扩增引物是：
F:ATGAATGCCGATACGCTGTT；
R:TTGAACCTGTCCTTGGAGC。
在本发明的一个优选实施方式中，内参基因ScTATA的实时荧光定量qRT-PCR扩增引物是：
F:CTGAAGTAAGGGTATCGTC；
R:TTCTGTAATGTTGGGACTA。
在本发明的一个优选实施方式中，内参基因ScTIP41的实时荧光定量qRT-PCR扩增引物是：
F:TCTGATTCTGCTGCTTACA；
R:TAGAGGTTACCAGGGACTT。
本发明的有益效果是：
（1）本发明选取13个功能多样的候选内参基因（涵盖核糖体蛋白、细胞骨架、代谢相关基因等类别），避免依赖单一类型基因导致的筛选偏差，为后续稳定性分析提供丰富的基因池。
（2）多算法综合评估体系：联合geNorm、NormFinder、BestKeeper三大主流内参基因评估软件及RefFinder在线整合工具，从不同算法原理（几何平均法、方差分析、相关性分析等）交叉验证候选基因的表达稳定性，避免单一软件的局限性，提升筛选结果的可信度。
（3）筛选出的稳定内参基因可作为工业大麻涝害胁迫下功能基因表达分析的可靠参照，为后续耐涝相关功能基因的挖掘、信号通路解析等研究提供关键技术支撑，推动工业大麻抗逆分子育种研究。
附图说明
图1为涝害胁迫下工业大麻不同组织总RNA琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中，A：“云麻7号”；B：“云麻10号”；M：DL2000 DNA Maker；1～5涝害胁迫下（0、2、4、6、8d）根的RNA样品；6～10涝害胁迫下（0、2、4、6、8d）茎的RNA样品；11～15涝害胁迫下（0、2、4、6、8d）叶的RNA样品；
图1
图2为候选内参基因在工业大麻不同组织中的PCR扩增结果，其中，A：根；B：茎；C：叶；M：DL2000 DNA Maker；1～12：Sc18SrRNA、ScUBQ、ScTUB、ScGAPDH、ScEF1“、ScPP2A、SceIF4E、ScTIP41、ScTATA、ScF-box、ScSAND、ScActin2；
图2
图3为涝害胁迫下工业大麻候选内参基因的溶解曲线；
图3
图4为工业大麻不同组织中10个候选内参基因的Ct值，其中，A：根；B：茎；C：叶；
图4
图5为工业大麻不同组织候选内参基因稳定性折线图，其中，A：根；B：茎；C：叶；D：根茎叶综合分析；
图5
图6为RifFinder软件分析工业大麻不同组织候选内参基因综合稳定性，其中，A：根；B：茎；C：叶；D：根茎叶综合分析；
图5
图7为涝害胁迫下工业大麻LOC115696956基因的稳定性验证，其中，左图为“云麻7号”，右图为“云麻10号”，A、B为根，C、D为茎，E、F为叶，G、H为根茎叶综合验证；
图6
图8为涝害胁迫下工业大麻LOC115695657基因的稳定性验证，其中，左图为“云麻7号”，右图为“云麻10号”，A、B为根，C、D为茎，E、F为叶，G、H为根茎叶综合验证。
图7
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，但本发明并不局限于这些内容。
实施例
实施例1
本发明涝害胁迫下工业大麻不同组织内参基因的筛选与表达稳定性分析，包括以下步骤：
1、材料准备与栽培：
供试材料为“云麻7号”和“云麻10号”，由云南省农业科学院经济作物研究所提供。将种子播种于塑料花盆中，种植基质为泥炭营养土：园土：珍珠岩=5:4:1(v:v:v)的混合基质，且每盆拌10g复合肥（N+P2O5+K2O≥38.0%）作为基肥。在工业大麻快速生长期（约70cm高）时，采用“双套盆”法（将种植大麻的有孔花盆放入底部无孔的花盆中进行涝害胁迫）对2个大麻品种进行涝害胁迫处理，每个处理12次重复，每个重复6株，于每天上午9点和下午6点补水，使土壤含水量过饱和，保持水面高出基质土表面3cm。同时，在涝害胁迫第0、2、4、6、8d时进行取样，选取两个品种的根、茎、叶作为试验材料，每个品种每个时间点设三次生
物学重复。取样后迅速放至液氮速冻，于-80℃超低温冰箱保存备用。
2、RNA提取和cDNA合成：
分别提取“云麻7号”和“云麻10号”涝害胁迫处理下不同时间点根、茎、叶的总RNA，每样品称取50~100mg，用液氮将其研磨至粉末状，使用TransZol Up Plus RNA Kit试剂盒（全式金生物有限公司）进行RNA提取。用1%琼脂糖凝胶电泳和NanoReady2000型超微量分光光度计检测RNA质量和浓度，结果如图1所示，28S和18S条带清晰明亮，且28S的亮度约等于18S的两倍，说明RNA未出现降解，质量较好。A260/A280值在1.8～2.1之间，表明RNA纯度较高，无蛋白质污染，可用于后续试验。cDNA反转录使用Easy Script®All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(One-Step gDNA Removal)试剂盒（全式金生物有限公司），按照说明书进行操作，于-20℃冰箱保存。
3、引物合成：
选取工业大麻的Sc18SrRNA、ScUBQ、ScTUB、ScGAPDH、ScEF1α、ScPP2A、SceIF4E、ScTIP41、ScTATA、ScPCS1、ScF-box、ScSAND、ScActin2，13个基因作为候选内参基因（表1），引物由昆明擎科生物科技有限公司合成。
表1 工业大麻13个候选内参基因的引物序列
4、实时荧光定量qRT-PCR反应
使用TapSYBR勇GreenqPCRPremix(Universal)试剂盒（江苏百时美生物科技
有限公司）在实时荧光定量PCR仪（RocheLightCycler勇96）上对内参基因的表达量进行检测。反应体系见表2，qPCR扩增程序见表3，溶解曲线使用仪器默认采集程序，每样品设3次重复。
表2 qPCR反应体系
表3 qPCR反应程序
5、引物特异性鉴定与扩增效率计算
将“云麻7号”和“云麻10号”涝害胁迫第0、2、4、6、8d的不同组织（根、茎、叶）cDNA进行等量混合，混合后的原液再稀释50、51、52、53、54倍进行qRT-PCR反应。标准曲线以已知的连续稀释浓度的对数为横坐标，对应浓度的Ct（cyclethreshold）值作为纵坐标，从而获得对应的斜率（k）及其线性相关系数（R2），扩增效率（E）根据公式E（%）=10-1/k-1计算得出。
结果显示，13个候选基因中有12个候选基因的扩增效率在90%～110%之间，其线性相关系数R2均在0.99以上，表明这12个引物具有良好的扩增效率（表4）。其中ScPCS1基因qRT-PCR结果不具有线性关系，且扩增效率低于90%，剔除此候选内参基因。
表4 候选内参基因的扩增效率和相关系数
对剩余12个候选内参基因的根、茎、叶进行常规PCR电泳检测，结果如图2所示，在根中ScUBQ和ScF-box基因有多条条带，在茎中ScUBQ基因条带颜色较浅，在叶中ScF-box基因出现两条条带，所以剔除ScUBQ和ScF-box两个候选基因。其余10个候选基因的目标扩增条带大小清晰正确，且都具有单一条带位置（100～250bp），无其他非特异性条带。为进一步保证后期分析数据的可靠性，通过实时荧光定量PCR检测剩余10个候选内参基因的引物特异性，结果表明，10个候选内参基因的产物溶解曲线均为明显信号单峰（图3），扩增曲线重复性好，具有很好的特异性，可以继续进行后续试验。
6、数据分析
6.1候选内参基因的表达分析
根据qRT-PCR检测结果，将工业大麻不同组织候选内参基因的Ct值绘制箱线图（图4）。在根组织中10个候选内参基因的Ct值为21.45～31.98，分布范围较广，其中表达水平受涝害胁迫处理影响较大的是ScTUB基因，最大值和最小值之间相差8.00，表达水平受影响较小的是ScGAPDH基因，最大值和最小值相差2.55（图4-A）。在茎组织中10个候选内参基因的Ct值为24.75～31.74，其中表达水平受涝害胁迫处理影响较大的是Sc18SrRNA基因，最大值和最小值之间相差5.53，表达水平受影响较小的是ScPP2A基因，最大值和最小值之间相差1.97（图4-B）。在叶组织中10个候选基因的Ct值介于19.64～27.02之间，其中表达水平受涝害胁迫处理影响较大的是ScGAPDH基因，最大值和最小值之间相差5.84，表达水平受影响
较小的是ScTATA基因，最大值和最小值相差3.07（图4-C）。
6.2涝害胁迫下工业大麻不同组织候选内参基因的表达稳定性分析
6.2.1geNorm软件分析
geNorm软件通过计算M值来筛选出稳定性较好的内参基因，当M<1.5，说明基因稳定表达，M值越小内参基因稳定性越好，反之则稳定性越差。从表5和图5可以看出，10个候选内参基因在不同组织中的M值均小于1.5，均符合内参基因稳定表达的要求。其中，在工业大麻根组织中SceIF4E和ScActin2基因表达稳定性最好，ScGAPDH基因表达稳定性最差。在茎组织中ScTATA和ScSAND基因表达稳定性最好，ScActin2基因表达稳定性最差。在叶组织中ScPP2A和ScTATA基因表达稳定性最好，ScGAPDH基因表达稳定性最差。综合根、茎、叶三个组织，SceIF4E和ScTIP41基因表达稳定性最好，Sc18SrRNA基因表达稳定性最差。
表5 geNorm软件分析内参基因的平均表达稳定性值
6.2.2 NormFinder软件分析
NormFinder软件与geNorm软件分析程序相似，通过比较候选内参基因的表达差异和组间变异获得内参基因的表达稳定值（S），S值最小的内参基因为最合适的内参基因。分析结果表明（表6），涝害胁迫处理下，10个候选基因中ScActin2基因在工业大麻的根组织中最稳定，SceIF4E基因在工业大麻的茎组织中最稳定，ScTATA基因在工业大麻的叶组织中最稳定，综合根、茎、叶三个组织分析，ScTIP41基因最稳定。
表6 NormFinder软件分析内参基因的表达稳定值（S）
6.3.3 BestKeeper软件分析
BestKeeper软件分析是根据内参基因的Ct值计算标准偏差（SD）和变异相关系数（CV），并以此评估各内参基因的稳定性，SD和CV值越低，则内参基因越稳定。由BestKeeper软件分析结果可知（表7），涝害胁迫处理下，在工业大麻根组织中ScGAPDH基因的SD和CV值分别为0.45和1.46，表达最稳定。在工业大麻茎组织中ScTATA基因的SD和CV值分别为0.41和1.54，表达最稳定。在工业大麻叶组织中ScTATA基因的SD和CV值分别为0.66和2.66，表达最稳定。同时，ScTATA基因也是综合根、茎、叶三个组织分析后最稳定的基因，其SD和CV值分别为1.06和4.07。
表7 BestKeeper软件内参基因稳定性分析
6.3.4RifFinder软件综合分析
RifFinder软件综合了geNorm、NormFinder、BestKeeper等多种算法对候选内参基因的综合稳定性进行排序。结果如图6所示，涝害胁迫处理下，10个候选内参基因的表达稳定性在工业大麻根组织中的排序为：ScActin2>ScEF1“>ScTIP41>SceIF4E>Sc18SrRNA>ScSAND>ScTATA>ScGAPDH>ScPP2A>ScTUB（图6-A）；在茎组织中的排序为：ScTATA>SceIF4E>ScSAND>ScPP2A>ScTUB>ScTIP41>ScGAPDH>ScEF1“>Sc18SrRNA>ScActin2（图6-B）；在叶组织中的排序为：ScTATA>ScPP2A>ScEF1“>ScTIP41>ScSAND>ScActin2>ScTUB>Sc18SrRNA>SceIF4E>ScGAPDH（图6-C）；综合根、茎、叶三个组织的排序为：ScTIP41>ScSAND>ScEF1“>ScPP2A>ScTUB>ScTATA>Sc18SrRNA>ScActin2>SceIF4E>ScGAPDH（图6-D）。
7、内参基因的稳定性验证
为了进一步验证筛选出的内参基因稳定性，本研究以涝害胁迫处理下工业大麻根组织中较为稳定的两个内参基因ScActin2和ScEF1“以及最不稳定的内参基因ScTUB，茎组织中较为稳定的两个内参基因ScTATA和SceIF4E以及最不稳定的内参基因ScActin2，叶组织中较为稳定的两个内参基因ScTATA和ScPP2A以及最不稳定的内参基因ScGAPDH，综合根、茎、叶三个组织中较为稳定的两个内参基因ScTIP41和ScSAND以及最不稳定的内参基因ScGAPDH，分别与前期涝害胁迫下工业大麻转录组测序结果中筛选到的两个耐涝目的基因LOC115696956和LOC115695657（表8）进行相对表达量分析。其中，目的基因LOC115696956属于ERF家族基因，作用于叶绿体，编码光系统I叶绿素a/b结合蛋白5，目的基因LOC115695657属于NF-YB家族基因，编码蛋白质MIZU-KUSSEI1，两者皆与光合作用相关，与工业大麻涝害胁迫相关。
验证结果如图7和图8所示，在以根、茎、叶不同组织以及综合根茎叶三个组织分析
筛选出的前两个较为稳定的内参基因作为标准化内参基因时，LOC115696956基因和LOC115695657基因在“云麻7号”和“云麻10号”不同组织中的表达量与表达趋势相似，而以最不稳定的内参基因作为标准化内参基因对其验证时，两个目的基因在“云麻7号”和“云麻10号”中的相对表达量发生明显改变，其表达趋势在不同时间点会出现过高或过低现象。
表8 耐涝目的基因引物序列
结论：本研究利用qRT-PCR方法，结合geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder软件对涝害胁迫下工业大麻不同组织内参基因进行筛选与表达稳定性分析，结果显示，不同组织中，根的最适内参基因为ScActin2，茎和叶的最适内参基因为ScTATA，综合根、茎、叶三个不同组织的最适内参基因为ScTIP41。本研究为涝害胁迫下工业大麻功能基因的表达分析提供了内参基因选择。
文章摘自国家发明专利，涝害胁迫下工业大麻不同组织的内参基因及其应用，发明人:杜光辉，王珊珊，汤开磊，欧阳文静，陈先敏，陈继康，申请号:202610161102.4，申请日:2026.02.04。
