摘  要：本发明提供了转录因子CsNF-YA及其在正调控汉麻CsCBCAS基因表达中的应用，属于基因工程技术领域。本发明提供了一种转录因子CsNF-YA，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明从汉麻酵母cDNA文库中筛选到转录因子CsNF-YA，转录因子CsNF-YA能够与汉麻CsCBCAS基因启动子特异性结合，过表达转录因子CsNF-YA能够显著促进CsCBCAS基因的表达，可运用于汉麻CBC合成遗传改良。

 

权利要求书

1.一种转录因子CsNF-YA，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.一种重组载体，其特征在于，插入有权利要求1所述的转录因子CsNF-YA。

3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体的骨架质粒包括pCAMBIA1300-RUBY。

4.一种重组菌，其特征在于，包含权利要求1所述的转录因子CsNF-YA或者包含权利要求2或3所述的重组载体。

5.权利要求1所述的转录因子CsNF-YA在正调控汉麻CsCBCAS基因表达中的应用。

6.权利要求2或3所述的重组载体或者权利要求4所述的重组菌在促进汉麻CsCBCAS基因表达中的应用。

7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述汉麻CsCBCAS基因表达包括汉麻毛状根中CsCBCAS基因表达。

8.权利要求1所述的转录因子CsNF-YA、权利要求2所述的重组载体或者权利要求3所述的重组菌在汉麻CBC合成遗传改良中的应用。

9.一种CBC合成遗传改良的方法，其特征在于，包括以下步骤：采用权利要求3所述的重组菌转染汉麻植株。

10.一种转基因汉麻，其特征在于，过表达转录因子CsNF-YA；所述转录因子CsNF-YA的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

 

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及转录因子CsNF-YA及其在正调控汉麻CsCBCAS基因表达中的应用。

 

背景技术

汉麻系大麻科大麻属雌雄异株的一年生双子叶草本植物。汉麻中已分离鉴定出超500种化学成分，如大麻素、酚萜类、黄酮类、甾体类、脂肪酸、生物碱等。大麻环萜酚（CBC）是主要大麻素之一，具有多种药用功效，可用于开发治疗疼痛、炎症、抑郁症等疾病的药物。

CBCAS基因是催化大麻素CBC合成的关键酶，但其转录调控机制仍不明确。在转录水平的调控网络中，启动子是一个核心且关键的调控元件，其通过形成特定的空间构象，为多种转录调控因子提供特异性结合位点。转录因子与启动子区域的顺式作用元件发生特异性结合后，可通过招募RNA聚合酶及转录辅助因子组装形成转录起始复合物，进而对下游靶基因的转录进程发挥激活或抑制调控作用，实现对基因表达的特异性调控。可见基因表达在很大程度上是由特定的转录因子所调控。然而，目前缺少对CBCAS的启动子区具有转录调控作用的转录因子。

 

发明内容

本发明的目的在于提供转录因子CsNF-YA及其在正调控汉麻CsCBCAS基因表达中的应用，转录因子CsNF-YA为CBCAS的表达调控运用于CBC遗传改良分子调控机制的研究提供了依据。

本发明提供了一种转录因子CsNF-YA，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明还提供了一种重组载体，插入有上述方案所述的转录因子CsNF-YA。

优选的，所述重组载体的骨架质粒包括pCAMBIA1300-RUBY。

本发明还提供了一种重组菌，包含上述方案所述的转录因子CsNF-YA或者包含所述的重组载体。

本发明还提供了上述方案所述的转录因子CsNF-YA在正调控汉麻CsCBCAS基因表达中的应用。

本发明还提供了上述方案所述的重组载体或者所述的重组菌在促进汉麻CsCBCAS基因表达中的应用。

优选的，所述汉麻CsCBCAS基因表达包括汉麻毛状根中CsCBCAS基因表达。

本发明还提供了上述方案所述的转录因子CsNF-YA、所述的重组载体或者所述的重组菌在汉麻CBC合成遗传改良中的应用。

本发明还提供了一种CBC合成遗传改良的方法，包括以下步骤：采用上述方案所述的重组菌转染汉麻植株。

本发明还提供了一种转基因汉麻，过表达转录因子CsNF-YA；所述转录因子CsNF-YA的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明提供了一种转录因子CsNF-YA，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明从汉麻酵母cDNA文库中筛选到转录因子CsNF-YA，转录因子CsNF-YA能够与汉麻CsCBCAS基因启动子特异性结合，过表达转录因子CsNF-YA能够显著促进CsCBCAS基因的表达，可运用于汉麻CBC合成遗传改良。

 

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为CsCBCASp启动子的PCR扩增和重组质粒pMD18-T-CsCBCASp双酶切结果图；其中，M为DL2000Marker，1为CsCBCASp启动子的PCR扩增条带，2为重组质粒pMD18-T-CsCBCASp双酶切鉴定；

  

图1

图2为重组质粒pAbAi-CsCBCASp双酶切鉴定图；其中，M为DL2000Marker，1为质粒双酶切结果；

  

图2

图3为诱饵菌株的PCR鉴定结果图；其中，M为DL2000Marker，1~4：pAbAi-CsCBCASp酵母菌落PCR；

  

图3

图4为诱饵载体自激活检测结果图；其中，p53-AbAi为Y1HGold[p53-AbAi]阳性对照菌株，pAbAi-CsCBCASp为Y1HGold[pAbAi-CsCBCASp]诱饵菌株；

  

图4

图5为次级文库插入片段大小及重组率鉴定结果图；其中，M为DL2000Marker，1~24：24个单克隆的菌落PCR鉴定；

  

图5

图6为CsNF-YA基因CDS序列的PCR扩增和重组质粒pGADT7-CsNF-YA双酶切结果图；其中，M为DL15000 Marker，1为CsNF-YA基因CDS序列的PCR扩增条带，2为重组质粒pGADT7-CsNF-YA双酶切鉴定；

  

图6

图7为酵母单杂交回转验证结果图；

  

图7

图8为CsNF-YA基因CDS序列的PCR扩增和重组质粒pET32a-CsNF-YA双酶切结果图；其中，M为DL15000 Marker，1为CsNF-YA基因CDS序列的PCR扩增条带，2为重组质粒pET32a-CsNF-YA双酶切鉴定；

  

图8

图9为CsNF-YA重组蛋白的诱导与纯化结果图；其中，M：低分子量蛋白Marker，1：CsNF-YA未诱导菌体；2：CsNF-YA诱导后菌体；3：CsNF-YA菌体诱导破碎后上清；4：CsNF-YA菌体诱导破碎后沉淀；5：流出液；6~7：洗脱液；

  

图9

图10为CsNF-YA蛋白与探针的结合情况结果图；其中，1：探针Probe1，2：CsNF-YA蛋白+探针Probe1，3：CsNF-YA蛋白+探针Probe1+20×冷探针Probe1，4：CsNF-YA蛋白+探针Probe1+50×冷探针Probe1，5：探针Probe2，6：CsNF-YA蛋白+探针Probe2，7：CsNF-YA蛋白+探针Probe2+20×冷探针Probe2，8：CsNF-YA蛋白+探针Probe2+50×冷探针Probe2，9：阳性蛋白+阳性探针，10：探针Probe3，11：CsNF-YA蛋白+探针Probe3；

  

图10

图11为CsNF-YA基因CDS序列的PCR扩增和重组质粒pCAMBIA1300-CsNF-YA-RUBY双酶切结果图；其中，M为DL15000 Marker，1为CsNF-YA基因CDS序列的PCR扩增条带，2为重组质粒pCAMBIA1300-CsNF-YA-RUBY双酶切鉴定；

  

图11

图12为qRT-PCR检测汉麻毛状根中基因的表达情况结果图；其中，A：CsNF-YA基因的相对表达量，B：CsCBCAS基因的相对表达量。

  

图12

 

具体实施方式

本发明提供了一种转录因子CsNF-YA，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，具体为：

atgacgtcttctgtgcatgaactttctgacaactgtgaggctgaagagcagcaaaaccactcagattctcagaaccagtcttcttctcctgcacctggaatgcctaatactgtaatgtcagctccaaatgttcagtatgcaactagtccgcaatttggagcaggacatgcagtggcaccggcggcagcttatccgtatccagatccttactaccgaagcatctttgctccctatgatgcacaaccttatcctccacagccttatgggggacaaccaatggtccatcttcagttaatggggatacagcaagctggtcttccattgccatcagatgccgttgaggaacctgtgtttgtgaatgcaaaacaatatcatggcatcttgcgacgccgacaatctcgtgcaaaagcagaatcagaaaataaagttatcaagtctaggaagccatacttgcatgaatctcgacatttgcatgcgttaagaagagctagaggatgtggaggcaggttccttaatgcgaagaaaaacgaaaagcatcaagatgaagaagatacacaggttgacaaatcacagtctcacatcaatttgaactcagataaaaacgaacgagcccctgcagatggcacaacttga。

本发明从汉麻酵母cDNA文库中筛选到转录因子CsNF-YA。

本发明还提供了一种重组载体，插入有上述方案所述的转录因子CsNF-YA。

作为一种实施方式，所述重组载体的骨架质粒包括pCAMBIA1300-RUBY；所述转录因子CsNF-YA在骨架质粒上的插入位点为KpnI和HindIII之间。

本发明还提供了一种重组菌，包含上述方案所述的转录因子CsNF-YA或者包含上述方案所述的重组载体。

作为一种实施方式，所述重组菌的出发菌株包括发根农杆菌，进一步为发根农杆菌K599。

本发明还提供了上述方案所述的转录因子CsNF-YA在正调控汉麻CsCBCAS基因表达中的应用。

在本发明中，转录因子CsNF-YA能够与汉麻CsCBCAS基因启动子特异性结合，过表达转录因子CsNF-YA能够显著促进CsCBCAS基因的表达。

本发明还提供了上述方案重组载体或者所述的重组菌在促进汉麻CsCBCAS基因表达中的应用。

作为一种实施方式，所述汉麻CsCBCAS基因表达包括汉麻毛状根中CsCBCAS基因表达。

本发明还提供了上述方案所述的转录因子CsNF-YA、所述的重组载体或者所述的重组菌在汉麻CBC合成遗传改良中的应用。

CBC是主要大麻素之一，具有多种药用功效，CBCAS是CBC生物合成中的关键酶。过表达转录因子CsNF-YA能够显著促进CsCBCAS基因的表达，可运用于汉麻CBC合成遗传改良。

本发明还提供了一种CBC合成遗传改良的方法，包括以下步骤：采用上述方案所述的重组菌转染汉麻植株。

作为一种实施方式，所述汉麻植株为减去根部的汉麻幼苗。

本发明还提供了一种转基因汉麻，过表达转录因子CsNF-YA；所述转录因子CsNF-YA的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明对用于构建所述转基因汉麻的汉麻植株的品种没有特殊要求。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的转录因子CsNF-YA及其在正调控汉麻CsCBCAS基因表达中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

本发明的实施例通过电泳迁移率实验明确了CsNF-YA与CsCBCAS基因启动子的特异性结合，确定了转录因子CsNF-YA在CsCBCAS启动子上的结合位点；在汉麻毛状根中证明CsNF-YA能够显著促进CsCBCAS基因表达，明确了转录因子CsNF-YA对CsCBCAS基因的转录正调控作用，为CsCBCA基因的表达调控带来了更深层次的认知，可运用于汉麻CBC合成遗传改良，具有较好的应用前景。

实施例1

1、CsCBCAS基因启动子序列的克隆及顺式元件分析

选取新鲜汉麻‘昶靖园1号’提取总DNA，提取方法参考天根植物基因组提取试剂盒说明书。NCBI中搜索汉麻CsCBCAS基因（XM_030625046.2）ATG的5'端上游500bp序列，利用Primer premire5.0软件设计上、下游引物，上游引物引入XhoI酶切位点，分别为SF（5’-GGGCTCGAGTTTGCATGACTATATTTCTACCTTACC -3’，SEQIDNo.3）和SR（5’-TTTTCTTCAGTCCTAATGATATTTTGA-3’，SEQ ID No.4）。PCR反应条件为：95℃预变性3min；94℃变性30s，56℃退火40s，72℃延伸火1min，共30个循环；72℃后延伸10min。PCR扩增获得长度约为500bp的序列，命名为CsCBCASp（图1）。将PCR扩增片段连接到pMD18-T克隆载体上，获得重组质粒pMD18-T-CsCBCASp，双酶切鉴定（图1），金唯智公司测序结果表明与NCBI中CsCBCAS基因ATG的5'端上游500bp序列的同源性为100%，测序结果如序列SEQ ID No.1，具体为：

tttgcatgactatatttctaccttaccaagttttttatctgataacaccctttcacttattattttcttatttttaatttatttatatttttaccatattctatttatactaatcttaagtggtacattacctccctgtggatacgacatataatctgtttactatcgtgaccgaagtataactaattgggcgacatcacacctatatcccacaaactagctactatagtcaatttcttgtttttttttccaatagccaattttaaatgatgccaaactattcaatgtataatgtacatttattttaaataagggcttcacctaacaaatgtgcctaattttagttaatttatttttttatcgcatctgactatttaaaggaactatcaaattataaaatatttatgtctattcatttgccccaactccaatatataatattataaataggatagttctctattcataataattcaaaatatcattaggactgaagaaaa。

生物信息学预测分析表明，CsCBCASp序列中含有激素响应元件：CARE（响应赤霉素GA元件，CAACTC，1个）、ERE（响应乙烯元件，ATTTTAAA，1个）；转录因子的结合位点：WRKY结合位点W-box（TGAC，1个）、MYC结合位点（CANNTG，1个）、DOF结合位点（AAAG，1个）、NF-YA结合位点（CCAAT，3个）。

2、诱饵载体的构建、转化及自激活检测

利用XhoI和HindIII限制性内切酶，将双酶切pMD18-T-CsCBCASp载体获得的小片段与双酶切后的pAbAi载体，采用T4连接酶16℃过夜连接。将重组载体命名为pAbAi-CsCBCASp，经转化大肠杆菌DH5α感受态细胞、质粒提取、双酶切鉴定（图2），金唯智公司测序验证序列正确。

将测序正确的诱饵载体（pAbAi-CsCBCASp）与p53-AbAi阳性对照载体分别用BstBI单酶切，使其在URA3基因处线性化，参照Coolaber生物公司Y1HGold感受态说明书进行转化酵母感受态。用无菌枪头挑取1~2mm大小长势饱满的单克隆至25μL无菌水中，吹打混匀，再加入25μL Matchmarker Insert Check PCR Mix 1，混匀置于PCR仪中。反应结束后电泳检测插入条带大小，条带大小应为1350bp+CsCBCASp片段长度，如图3所示，诱饵菌株PCR扩增获得约为1850的条带，将验证正确的诱饵酵母单菌落制备成甘油菌于-80℃保存。

挑取鉴定正确的Y1HGold单菌落，涂布于含有不同浓度AbA（0、100、200、300、400、500ng/mL）的SD/-Ura平板上，结果如图4所示，当抗生素AbA浓度是100ng/mL时，平板有少量酵母生长，浓度是200ng/mL时，酵母不能生长，为保证文库筛选阳性率，最终选用浓度200ng/mL AbA用于后续酵母cDNA文库筛选以及回转验证实验。

3、酵母cDNA文库构建

选取汉麻雌株花、苞片、叶片及幼叶，利用Gateway技术构建酵母cDNA文库。在分离纯化mRNA的基础上，合成了3种读码框的双链cDNA，通过BP反应构建相应的初级文库，总库容量为1.92×107CFU，再通过LR反应构建高质量的次级文库，总库容量为1.60×107CFU。根据入门载体pDONR222序列设计引物（P1：5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’，SEQ ID No.5和P2：5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’，SEQ ID No.6）和pGADT7载体上的通用引物（T7：5’-TAATACGACTCACTATAGGGC-3’，SEQ ID No.7和3’AD：5’-AGATGGTGCACGATGCACAG-3’，SEQ ID No.8），随机挑取24个克隆，菌落PCR鉴定表明初级文库和次级文库中插入片段长度均在750bp以上（图5），且均为有条带的阳性克隆，重组率为100%，说明初级、次级文库的质量较高，可用于后续实验。

4、酵母单杂筛选

酵母文库单杂筛选中，将次级文库质粒转化到制备好的诱饵酵母感受态pAbAi-CsCBCASp中，使PEG/LiAc法进行转化，用6mL0.9%NaCl重悬菌液，取10μL按1/10、1/100、1/1000浓度比例梯度稀释后涂布于SD/-Leu固体培养基中，根据生长的菌落数，计算转化效率为2.5×106CFU/μg，可进行后续筛选。剩余菌液涂布于SD/-Leu/AbA200平板，相同的培养基上进行二次筛选，挑取单克隆分别接种于3mL的SD/-Leu液体培养基中，参考Omega酵母提取试剂盒提取酵母质粒。以酵母质粒为模板，以T7和3′AD为引物进行阳性克隆鉴定，将＞500bp的PCR产物送至生物公司测序。测序结果通过NCBI中BLAST进行序列比对分析和功能注释。共筛选到的结合蛋白数目为47个，8个未表征序列，1个是转录因子，为NF-Y家族成员NF-YA（核苷酸序列如SEQ ID No.2），出现了6次，其余是一些结构蛋白和酶。

5、汉麻CsNF-YA基因CDS序列的克隆及回转验证

根据候选转录因子CsNF-YA的CDS序列及pGADT7载体的多克隆位点，设计引入NdeI和EcoRI酶切位点的特异引物（H1：5’-GGGCATATGATGACGTCTTCTGTGCATGAAC-3’，SEQ ID No.9和H2：5’-GGGGAATTCTCAAGTTGTGCCATCTGCAGG-3’，SEQ ID No.10），T4连接酶将扩增片段（图6）与双酶切（NdeI和EcoRI）后的pGADT7载体连接，重组载体命名为pGADT7-CsNF-YA，双酶切鉴定（图6）后测序，测序结果与NCBI中的序列同源性为100%。

将验证正确的阳性克隆质粒pGADT7-CsNF-YA，转化pAbAi-CsCBCASp诱饵载体的Y1HGold感受态细胞中。通过SD/-Leu培养基筛选获得双质粒共转化酵母菌株，待阳性克隆长出后挑取单菌落，于SD/-Leu液体培养基中30℃过夜振荡培养，梯度稀释后，取3μL菌液点样于含200ng/mL AbA的SD/-Leu缺陷型培养基上。结果如图7所示，阳性对照P53-AbAi+pGADT7-53和共转化后的pAbAi-CsCBCASp+pGADT7-CsNF-YA的酵母菌株能够在添加200ng/mL AbA的SD/-Leu培养基上生长，阴性对照pAbAi-CsCBCASp+pGADT7的酵母菌株不能生长，表明CsNF-YA蛋白与CsCBCASp启动子序列结合激活了pAbAi载体中的AbAr报告基因的表达，转录因子CsNF-YA与CsCBCASp之间存在相互作用。此外，随着酵母菌液浓度的逐渐降低，菌落分布更为稀疏。

实施例2电泳迁移率实验（EMSA）

根据实施例1得到的CsNF-YA基因的CDS序列及载体pET32a的多克隆位点，设计引入EcoRI和HindIII酶切位点的特异引物（K1：5’-GGGGAATTCATGACGTCTTCTGTGCATGAAC-3’，SEQ ID No.11和K2：5’-GGGAAGCTTTCAAGTTGTGCCATCTGCAGG-3’，SEQ ID No.12），T4连接酶将扩增片段（图8）与双酶切（EcoRI和HindIII）后的pET32a载体连接，重组载体命名为pET32a-CsNF-YA，转化大肠杆菌Transetta（DE3）感受态细胞、质粒提取、双酶切鉴定（图8）后测序，测序结果与NCBI中的序列同源性为100%。

16℃下添加终浓度为0.2mM的IPTG，充分诱导Transetta中重组pET32a-CsNF-YA蛋白的表达。采用Ni柱亲和层析纯化目标蛋白，通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色进行检测分析。SDS-PAGE分析结果显示（图9），CsNF-YA重组蛋白在40kDa处左右有明显增粗的条带（Lane2），表达的重组蛋白大小与预期相符，未诱导菌体40kDa处没有明显增粗的带（Lane1），说明CsNF-YA重组蛋白经IPTG诱导后可以在Transetta（DE3）菌株中稳定有效地表达。蛋白在上清和沉淀中均有表达（Lane3、4），选择破碎上清进行纯化，经Ni柱纯化后，在洗脱液中得到了高纯度的CsNF-YA重组蛋白（Lane6、7）。

根据NF-Y转录因子家族的结合特性，在CsCBCASp序列中找到三处可能的结合位点CCAAT元件，根据三处结合元件上、下游序列，用生物素在其5′端标记形成结合探针（Probe1：5′-TGTTTTTTTTTCCAATAGCCAATTTTAAATGATG-3′，SEQ ID No.13；Probe2：5′-TCATTTGCCCCAACTCCAATATATAATA TTATAAA-3′，SEQ ID No.14），未标记的作为冷竞争探针，及CCAAT的反向互补序列合成探针（Probe3：5′-ACCGAAGTATAACTAATTGGGCGACATCACACCTA-3′，SEQ ID No.15）。

通过6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，电泳后转移到尼龙膜上，使用化学发光成像系统检测。结果如图10所示：阳性蛋白与阳性探针可以特异性结合，从而形成滞后带（Lane9）；自由探针单独存在的泳道中没有滞后带形成（Lane1、5、10）；当CsNF-YA蛋白分别与Probe1、Probe2探针混合时，重组蛋白与CCAAT探针特异结合，形成DNA-蛋白质复合物，在泳道顶部形成明显的滞后条带（Lane2、6），并且滞后带随着冷竞争探针浓度的增加而减弱，表明标记探针和蛋白的结合作用可被未标记的冷竞争探针抑制（Lane3、4，Lane7、8）。相反，当CsNF-YA蛋白与Probe3探针混合时，不能形成DNA-蛋白质复合物，泳道中没有滞后带形成（Lane11）。以上结果表明，CsNF-YA蛋白在体外可以与CCAAT元件特异结合，与其反向互补序列不能结合。

实施例3转录因子CsNF-YA在汉麻毛状根中促进CsCBCAS基因表达

将CsNF-YA基因的CDS序列构建到pCAMBIA1300-RUBY载体中，上游引物引入KpnI酶切位点，即K3：5’-GGGGGTACCATGACGTCTTCTGTGCATGAAC-3，SEQ ID No.16），下游引物为K2，T4连接酶将扩增片段（图11）与双酶切（KpnI和HindIII）后的pCAMBIA1300-RUBY（购自丰晖生物公司）载体连接，重组载体命名为pCAMBIA1300-CsNF-YA-RUBY，双酶切鉴定（图11）后测序，测序结果与NCBI中的序列同源性为100%。

选择阳性质粒转化发根农杆菌K599。挑选生长1个月左右的健壮汉麻幼苗，剪去根部，插入菌液中，30Hz超声1min，黑暗侵染1d，侵染后在光照/黑暗周期为16h/8h的条件下培养。培养约60d时，选取侵染后转变为红色的根。根据CsNF-YA和CsCBCAS的基因序列设计qRT-PCR检测引物，分别为如下：

E1：5’-AGATGCCGTTGAGGAACCTG-3’，SEQ ID No.17；

E2：5’-G AACCTGCCTCCACATCCTC-3’，SEQ ID No.18；

F1：5’-GCTCACGACTCACTTCAGAACTAG-3’，SEQ ID No.19；

F2：5’-GTAGAAGATGGTTGTATCAATCCAGCTC-3’，SEQ ID No.20；

内参基因为CsEF1a；

上游引物为W1：5’-TGTTTTGCACGGATCAGTTTG-3’，SEQ ID No.21；

下游引物为W2：5’-AATGCCGACCGCTACAGTTC-3’，SEQ ID No.22；

qRT-PCR检测CsNF-YA和CsCBCAS基因分别在CK（转pCAMBIA1300-RUBY载体的根）和CsNF-YA-RUBY（转pCAMBIA1300-CsNF-YA-RUBY载体的根）中的表达情况。结果表明在转CsNF-YA-RUBY的汉麻根中，CsNF-YA基因过表达，表达量显著升高，其相对表达量是对照CK的3.56倍（图12中的A）；CsCBCAS基因在过表达CsNF-YA的毛状根中的相对表达量是对照CK的6.21倍（图12中的B），说明CsNF-YA可以显著正向调控CsCBCAS基因表达，可运用于汉麻CBC合成遗传改良。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

 

文章摘自国家发明专利，转录因子CsNF-YA及其在正调控汉麻CsCBCAS基因表达中的应用，发明人:赵艳，杨将，李珊珊，桑莹莹，魏爽，翟莹，申请号:202610059779.7，申请日:2026.01.16。