摘 要：探讨罗布麻叶不同极性溶剂提取物对高脂血症的调节作用及其机制.体内实验表明，罗布麻叶各提取物能显著降低高脂血症大鼠血清TC、TG及LDL-C水平（P<0.001或P<0.05），提高HDL-C水平（P<0.001），并改善肝脏组织病理变化.网络药理学筛选出罗布麻叶与HLP的共同靶点91个，基因本体论（GO）与京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析提示其作用机制可能与AGE-RAGE、TNF、IL-17、p53和PI3K-Akt等信号通路相关.分子对接验证显示，罗布麻叶活性成分芦丁、异槲皮苷、紫云英苷、白麻苷、槲皮素、金丝桃苷、山奈酚与绿原酸与核心靶点BCL2、AKT1、MMP9、PTGS2、TP53、ESR1具有良好结合潜力.
关键词：罗布麻叶，高脂血症，调节血脂，网络药理学
高脂血症（Hyperlipidemia）或称高脂蛋白血症（Hyperlipoproteinemia），是指血清脂质代谢紊乱，其特征性表现为血清总胆固醇（total cholesterol,TC）、甘油三酯（triglyceride,TG）和低密度脂蛋白水平（Low Density Lipoprotein Cholesterol,LDL-C）升高，以及高密度脂蛋白水平（HDL-C）降低[1].随着人们生活水平的提高，高脂血症的发病率呈逐年增长，据统计中国成年人血脂异常发病率超过41%[2].血脂异常作为引起心血管疾病的高危因素，所以调脂治疗尤为重要.目前临床常用调脂药物包括他汀类、贝特类等[3].但是他汀类药物治疗的个体差异性、不良反应和“他汀疗效6%效应”制约着治疗效果；贝特类药物具有损害肝肾功能和横纹肌溶解症的不良反应[4].近年来，中医及少数民族医药采用口服药物联合其他疗法的综合模式，在提升临床疗效、优化患者生活质量方面展现出积极效果，加之不良反应可控，使其在临床获得广泛应用。
罗布麻叶（Apocynum venetumL.）为夹竹桃科多年生草本宿根植物罗布麻的干燥叶，具有平肝安神、清热利水之功效[5]，现代药理研究表明，其具有显著的降压、调脂、抗氧化、抗衰老及保肝等活性[6-8].布麻叶主要化学成分包括黄酮类、有机酸类、甾体类化合物等，其中黄酮类成分被确认为其有效活性物质[9,10].多项研究表明，罗布麻叶总黄酮提取物可显著改善高脂血症（Hyperlipidemia,HLP）模型大鼠血清血脂水平，有效降低血脂综合指数及动脉硬化指数[11-13]，表明其能有效调节血脂代谢紊乱，对动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）具有一定防治潜力.
尽管罗布麻叶的调脂作用已有较多文献报道，但不同极性溶剂提取部分的化学组成存在显著差异，而关于不同极性溶剂提取物调脂效果的系统性对比研究相对匮乏.本研究拟采用不同极性溶剂对罗布麻叶进行提取，获得各极性部位提取物.通过高脂饲料诱导建立HLP大鼠模型，系统评价罗布麻叶各极性溶剂提取物对模型动物血脂水平的调节作用，并考察其对肝脏的组织病理学改变及肝肾脾功能指标的影响，以综合评估其对高脂血症所致代谢紊乱的干预效果.同时整合网络药理学与分子对接技术，构建“罗布麻叶活性成分-作用靶点-高脂血症相关通路”网络，旨在深入阐明其防治HLP的多靶点、多层次作用机制，为罗布麻叶资源的深度开发利用提供坚实的科学依据.
1 材料与仪器
1.1 动物
雄性SD大鼠48只，SPF级，3月龄，体重200±20g（河南斯克贝公司），动物生产许可证号：SCXK（豫）2020-0005.动物饲养于新疆第二医学院动物实验中心.本研究经新疆医科大学伦理委员会审核批准（伦理审批号：IACUC-20220728-24）.
1.2 材料
罗布麻叶购自克拉玛依市区大药房，经新疆第二医学院何先元教授鉴定为夹竹桃科植物罗布麻（Apocynum venetumL）干燥的叶.辛伐他汀（批号：6022528，10mg×30片，山东凤凰制药股份有限公司），甲醇（天津市鑫铂特化工有限公司，产品批号：20220108），95%乙醇（天津市鑫铂特化工有限公司，产品批号：20231205），高脂饲料（成分：基础饲料87.3%、猪油10%、胆固醇2%、胆盐0.5%、丙硫氧嘧啶0.2%，批号：2404-09，安徽邦府生物饲料有限公司）；基础饲料（产品批号：2022-03，沈阳市于洪2区前珉饲料有限公司）.TG（货号A110-1-1）、TC（货号A111-1-1）、HDL-C（货号A112-1-1）、LDL-C（货号A113-1-1）试剂盒（南京建成生物工程研究所）.
1.3 仪器
FA2104N分析天平（上海菁海仪器有限公司）；MultiskanFC酶标仪（赛默飞世尔（上海）有限公司）；HC-2518R高速冷冻离心机（上海齐欣科学仪器有限公司）；DHP-9082电热恒温培养箱（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；KQ-700DE数控超声仪（昆山市超声仪器有限公司）；R-1001VN旋转蒸发仪（郑州长城科工贸有限公司）.
2 实验步骤与方法
2.1 动物实验
2.1.1 罗布麻叶提取物的制备
1）水提醇沉上清部分制备：取罗布麻叶50g，置于2L的圆底烧瓶中，加入15倍量水，加热回流3次，每次1h.合并滤液，浓缩滤液到浓度为1g/ml.加95%乙醇至乙醇浓度为80%沉淀，静置24h.过滤后所得滤液减压浓缩至浸膏得部位3，即为罗布麻叶水提醇沉上清部分.
2）60%乙醇加热回流提取物：取罗布麻叶50g，置于2L的圆底烧瓶中，加入15倍量60%乙醇溶液，加热回流3次，每次1h.合并滤液，浓缩至浸膏得部位2，即为罗布麻叶60%乙醇回流提取部分.
3）80%甲醇超声提取物：取罗布麻叶50g，置于具塞锥形瓶中，加入20倍量80%甲醇超声（53kHz、250W）提取2次，每次1h.合并滤液，浓缩至浸膏得部位1，即为罗布麻叶80%甲醇超声提取部分.
根据出膏率，向罗布麻叶不同溶剂提取物中加入适量的蒸馏水混匀，于60℃水浴加热并不断搅拌至完全溶解，使每毫升含罗布麻叶0.125g，给药量为2.0mL/200g.
2.1.2 动物分组及给药
雄性SD大鼠48只，体重(200±20)g，自由进食和饮水，适应性喂养7 d以后，按随机分组方法分为6组，每组8只，即空白组、模型组、阳性（辛伐他汀）组、水提组、乙醇回流组和甲醇超声组.空白组给予基础饲料喂养，其他组均给予高脂饲料喂养，持续4周.从造模第一日开始给药，阳性组给予辛伐他汀（剂量相当于临床等效剂量），其他组分别给予不同的罗布麻叶提取物，空白组和模型组给予等量生理盐水.每日1次，给药体积为10mL/（kg·d），连续灌胃4周.实验过程中，每周称重2次，并根据体重及时调整给药量.期间，所有大鼠可随意获得水和食物.
2.1.3 大鼠血清生化指标检测
实验期间，每天注意观察大鼠的基本状态，包括饮食情况、活动量、大小便、外观及毛发情况.对各脏器进行称重，计算各脏器系数；取各组小鼠肝脏的同一部位于4%多聚甲醛固定，进行HE染色及病理观察；取部分血清测定各组大鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C水平.
2.1.4 统计学方法
采用SPSS 26.0软件对实验数据进行统计分析，数据以均值±标准差(±s）表示.组间差异比较使用t检验，多组间差异比较使用单因素方差分析（One-Way ANOVA），统计显著性水平设定为 P<0.05.
2.2 网络药理学研究
2.2.1 药物作用靶点预测
根据前期实验表征的罗布麻的主要活性成分，借助小分子生物活性数据库（PubChem：www.pubchem.com/）收集整理罗布麻叶中单体的化学结构或SMILES号，使用SwissTarget Prediction数据平台来预测罗布麻叶的潜在作用靶点，保留“Probability”值大于0的靶点.
2.2.2 HLP潜在作用靶点筛选及“罗布麻叶-HLP”作用靶点获取
利用GeneCards、OMIM和DisGeNET数据库获取HLP相关的靶基因.经Excel去重后，建立HLP靶点数据集.采用Draw Venn Diagram绘制“罗布麻叶-HLP”的Venn图，以确定两者的交集靶点.
2.2.3 靶点蛋白互作网络（PPI）构建
基于STRING数据库构建“罗布麻叶防治HLP”的PPI网络（物种：Homo），导出.tsv文件.使用Cytoscape 3.7.1绘制交集靶点的PPI网络，并借助其内置的CytoNCA与BisoGenet插件进行网络拓扑分析.核心靶点根据节点度（Degree）值筛选确定.
2.2.4 GO和KEGG通路富集分析
利用DAVID在线平台对“罗布麻叶-HLP”的交集靶点进行GO和KEGG通路富集分析.设定P≤0.05为显著性阈值筛选富集结果.所得显著富集的通路信息通过微生信平台进行可视化，生成GO及KEGG富集气泡图.
2.2.5 分子对接分析
针对罗布麻叶主要活性成分与核心靶点（2.2.3节所得）进行分子对接.配体（活性成分）的SDF文件来源于PubChem数据库，受体核心靶点的PDB文件来源于PDB数据库.对接实验利用CB-Dock2在线平台执行，并对结果进行可视化.
3 结果
3.1 动物实验
3.1.1 罗布麻叶提取物的制备
水提醇沉上清部分制备得到浸膏15.61 g，出膏率为31.22%.60%乙醇加热回流提取得到浸膏15.98 g，出膏率为31.96%.80%甲醇超声提取得到浸膏16.11 g，出膏率为32.17%.
3.1.2 大鼠一般情况
空白组大鼠实验期间一般状态良好，毛色光泽，进食进水正常，活动灵敏，大小便正常.模型组大鼠实验期间出现毛色褪色，局部脱毛，皮肤炎症甚至破溃等状态；造模21 d后，进食进水及活动量减少，体重增长缓慢，大小便减少，精神萎靡.给药组大鼠经药物干预后，进食量、饮水量及活动量较模型组有所改善，大便趋于正常.实验结束后，水提组、乙醇回流组和甲醇超声组大鼠体重明显低于模型组大鼠.正常组大鼠皮下和肠周围仅有少量脂肪分布，其余各组皮下和肠周围均有较多脂肪层分布，且模型对照组脂肪量较阳性组和其他罗布麻叶提取物给药组更为明显，脂肪颜色偏深.
图1 罗布麻叶对小鼠体重的影响（n=8）
3.1.3 罗布麻叶提取物对HLP大鼠肝组织病理形态的影响
空白组大鼠肝组织胞质胞核清晰，肝血窦清晰可见无充血，肝索排列整齐.模型组肝细胞排列紊乱，肝脏内出现严重的细胞脂肪变性，肝细胞增大，细胞质内出现大量大小不一的空泡状，肝血窦消失，细胞核消失，肝质肿胀、融合， 呈现空泡变性，肝索排列紊乱.与模型组相比，各给药组肝细胞空泡状较少，肝索排列较整齐. 以上数据说明各给药组对HLP造成的肝损伤有一定的保护作用，罗布麻叶乙醇回流提取物和甲醇超声提取物保护作用更为显著.
图2 罗布麻叶对肝脏病理形态学的影响（n=3）
3.1.4 罗布麻叶提取物对HLP大鼠肝、肾脏、脾脏指数的影响
与空白组相比，模型组大鼠肝指数、肾脏指数、脾脏指数显著升高（P<0.001）；
与模型组相比，阳性组大鼠肾脏指数、脾脏指数显著下降（P<0.001）；其他各给药组脏器指数均有不同程度的下降（P<0.05或P<0.01或P<0.001），以上数据表明罗布麻叶的不同提取物可以降低HLP大鼠升高的的脏器指数.结果见表1.
表1 罗布麻叶提取物对 HLP 大鼠内脏指数的影响（x?±s）
注：与空白组比较，###P<0.001；与模型组相比，*P<0.05 ，**P<0.01 ，***P<0.001 ，n=8.
3.1.5 罗布麻叶提取物对HLP大鼠血脂指标的影响
模型组大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平较空白组显著升高（P<0.001），HDL-C水平明显降低（P<0.05），提示成功诱导血脂异常.各给药组均能有效改善上述异常：显著降低升高的TC、TG及LDL-C水平（P<0.001或P<0.05），并提升降低的HDL-C水平，甲醇超声组对HDL-C水平无显著影响.结果表明，罗布麻叶提取物能改善HLP大鼠血清中的血脂水平乱.结果见表2.
表2 罗布麻叶提取物对HLP大鼠血脂指标的影响（x?±s）
注：与空白组比较，#P<0.05 ，###P<0.001；与模型组相比，*P<0.05 ，**P<0.01 ，***P<0.001 ，n=8
图4 罗布麻叶对大鼠血脂水平的影响
注：与空白组比较，#P＜0.05 ，###P＜0.001；与模型组相比，*P＜0.05 ， ***P＜0.001 ，n=8.
3.2 网络药理学结果
3.2.1 药物活性成分筛选及作用靶点预测
利用Swiss Target Prediction数据平台，预测各成分的潜在作用靶点，整合去重后共得到罗布麻叶潜在作用靶点388个.
3.2.2 HLP疾病潜在作用靶点筛选及罗布麻叶- HLP作用靶点获取
通过数据库挖掘到的HLP疾病靶点去重后得到3367个，取HLP疾病靶点与罗布麻叶交集靶点91个，并绘制Venn图，如图5.
图5 Venn图
3.2.3 软坚散结方活性成分防治高脂血症的调控网络构建
基于Cytoscape 3.7.1平台，对91个交集靶点的PPI网络进行拓扑分析，该分析借助CytoNCA与BisoGenet插件完成.根据degree大小进一步筛选出核心靶点并构建蛋白互作网络图，如图6所示.
图6 PPI图
3.2.4 “信号通路-靶点”网络图
得到GO富集分析（P<0.05），选择CC、MF和BP富集高的前5个进行可视化，如图7所示；生物过程主要涉及对外来刺激的反应（response toxenobiotic stimulus）、基因表达的正向调控（positive regulation of gene expression）、凋亡过程负向调控（negative regulation of apoptotic process）、细胞群增殖的正向调节（positive regulation of cell population proliferation）及RNA聚合酶II正调控转录（positive regulation of transcription by RNA polymerase II）等.得到KEGG富集分析（P<0.05），前15条通路主要富集在AGE-RAGE、TNF、IL-17、p53、PI3K-Akt、脂质与动脉粥样硬化和细胞凋亡信号通路等信号通路，见图8.
图7 GO富集结果
图8 KEGG富集结果
3.2.5 分子对接分析
将得到的核心靶点BCL2、AKT1、MMP9、PTGS2、TP53、ESR1与罗布麻叶化学成分对接.对接结果小于-5.0 kcal/mol代表结合潜力高.如图9所示，活性成分与靶点蛋白的结合能介于-4.7~-9.9 kcal/mol之间，部分结合示意图如图10所示.
图9 核心靶点分子对接结合能色阶图
图10 分子对接示例图
4 讨论
罗布麻叶为夹竹桃科植物罗布麻（Apocynum venetumL.）的干燥叶，为多年生草本宿根植物，其药用记载历史最早可追溯至汉代.后因历代药物品种混乱，致使该药退出中医药学舞台，但其在民间以及少数民族中一直使用.《中国药典》于1977版首次记载，2020年版《中国药典》记载其味甘、苦、凉，归肝经，具有平肝安神、清热利水之功，用于肝阳眩晕、心悸失眠、浮肿尿少等证.罗布麻在新疆地区可以广泛种植，现代药理研究表明其主要成分可以有效降血压、降血脂，因此具有较高的开发与利用价值.
本研究结果显示，水提组、乙醇回流组和甲醇超声组均能降低HLP大鼠血清TC、TG及LDL-C水平，水提组和乙醇回流组均能升高HLP大鼠血清HDL-C水平；与模型组相比，各给药组肝细胞空泡状较少，肝索排列较整齐.表明罗布麻叶各溶剂提取物可以改善HLP大鼠的血脂水平，且对HLP造成的肝损伤有一定的保护作用.罗布麻叶乙醇回流提取物和甲醇超声提取物对肝脏的保护作用更强，水提物对血浆血脂水平的改善作用更强.前期实验表征出罗布麻叶水提组含有白麻苷、金丝桃苷、异槲皮苷、紫云英苷和槲皮素成分，乙醇回流组含有绿原酸、白麻苷、金丝桃苷、异槲皮苷和紫云英苷成分，甲醇超声组含有绿原酸、白麻苷、金丝桃苷、芦丁、异槲皮苷、紫云英苷、槲皮素和山奈酚成分.甲醇超声组表征出的化学成分较多，但改善血脂水平的效果不及其他两组，可能化学成分的不同影响其药效结果.基于此，后续实验可以探讨不同成分的组方防治高脂血症的研究，为罗布麻叶的深度开发提供依据.
基于网络药理学的研究方法，筛选出罗布麻叶抗HLP的靶点共91个，其中核心靶点可能是：BCL2、AKT1、MMP9、PTGS2、TP53、ESR1.KEGG富集与HLP的相关信号通路共128条，核心通路是：AGE-RAGE、TNF、IL-17、p53和PI3K-Akt等信号通路.分子对接显示各化学成分与和核心靶点均具有自发结合潜力.BCL2可以通过线粒体途径抑制细胞凋亡.细胞凋亡参与正常细胞的更新、免疫系统的正常发育以及化学因素诱导的细胞死亡.BCL2可以抑制关键凋亡执行者caspase 3从而抑制凋亡的发生.最近研究表明黄蛭口服液可以促进BCL2表达的增加抑制高脂血症小鼠肝组织细胞的凋亡[14].本研究中，罗布麻叶各溶剂提取物对HLP造成的肝损伤可能通过BCL2发挥保护作用.AKT1蛋白是AKT激酶家族的一部分，AKT1是内皮细胞eNOS活化的经典激酶，它在葡萄糖稳态、蛋白质合成、脂质代谢、细胞增殖和存活中发挥重要的调节作用[15,16].研究发现PI3K-Akt信号通路可以降低血清TNF、IL-1β等炎症因子的表达[17].血清中的炎症影响HLP的发生发展.MMP9主要由巨噬细胞以酶原形式分泌，激活后降解血管内皮细胞间质纤维类胶原及侵蚀斑块纤维帽，在动脉粥样硬化斑块型形成、破裂及引起心血管事件过程发挥重要作用，可作为反应高脂血症患者AS状态及预后的指标[18].甲羟戊酸途径受肿瘤蛋白P53（TP53）作用的影响，当TP53功能缺乏时，甲羟戊酸途径受损，体内胆固醇合成减少含量降低[19].ESR1是一种核内生物大分子，研究表明，ESR1的升高预示着HLP发病的风险.现代药理研究表明，AGE-RAGE信号通路与代谢性疾病密切相关[20,21].HLP能诱导AGE受体的表达，激动核因子-κB信号通路进而促进炎症细胞因子TNF、IL-1β的表达[22].综上所述基于网络药理学和分子对接的研究，罗布麻叶可多靶点多通路发挥抗HLP的作用.
5 结论
本研究使用不同溶液提取罗布麻叶，观察罗布麻叶不同极性溶剂提取物的体内降血脂，肝、肾、脾保护作用.体外实验表明水提物的血脂改善作用更佳明显，而罗布麻叶乙醇回流提取物和甲醇超声提取物的肝脏保护作用更强.同时基于网络药理学挖掘的罗布麻叶通过AGE-RAGE、TNF、IL-17、p53和PI3K-Akt等信号通路抗高脂血症，可为今后的药物开发和基础试验提供依据.
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文章摘自：靳雅，张荣，王洋洋，陈嘉媛，丁茂鹏，信小兵，施洋，杨英来．基于网络药理学及实验验证探讨罗布麻叶防治高脂血症的作用机制[J/OL]．云南民族大学学报(自然科学版). https://link.cnki.net/urlid/53.1192.n.20251022.1647.002
