摘 要：本发明公开了一种日中性工业大麻的花型逆转微繁方法，包括种子灭菌与萌发?体外培养花逆转处理?愈伤组织的形成?芽分化的形成?生根与驯化。具体过程中取雌花上的苞片灭菌后放入培养基中培养，苞片产生愈伤组织，愈伤组织上分化出花芽，花芽伸长后移到生根培养基中生根，将生根的幼苗移栽到土壤中，获得的植株是一株日中性的工业大麻。本发明探索了花型逆转在日中性工业大麻微繁中的应用潜力，为改进育种和繁殖方法提供新方向，并且填补了日中性工业大麻繁殖技术的空白，还为工业大麻产业的可持续发展奠定基础。
技术要点
1.一种日中性工业大麻的花型逆转微繁方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：种子灭菌与萌发
选取饱满且健康的工业大麻种子，先浸泡于无菌水中在暗环境下，随后将种子表面灭菌，最后将处理好的种子接种至1/2MS培养基上；
步骤二：体外培养
将接种后的种子置于培养环境中，当植株生长至花序的白色柱头小花从顶芽中出现时，将其转移至DKW培养基中；
步骤三：花逆转处理
将花序作为花外植体进行解剖，取雌花上的苞片灭菌后随即放入DWK培养基中进行培养；
步骤四：愈伤组织的形成
在花外植体培养至观察到花伤口部位开始形成愈伤组织，将愈伤组织在DWK培养基中继续培养7天，之后将愈伤组织转移至芽分化培养基；
步骤五：芽分化的形成
在芽分化培养基中培养至分化的芽长至约5cm时，将其移至生根培养基中；步骤六：生根与驯化
将生根培养基放置在温度为25℃、光周期为16h光照、8h黑暗、光强度为30μmols?1m?2的环境下，培养21天后，将已形成可见根的芽外植体转移至生长室条件下，将植物保持在长日照光周期下，经过60天的培养，植株发育为完全成熟的植物。
2.根据权利要求1所述的一种日中性工业大麻的花型逆转微繁方法，其特征在于，步骤一中无菌水中浸泡48h，种子表面灭菌采用质量分数10％的次氯酸钠溶液表面灭菌15min，灭菌完成后无菌水冲洗三次。
3.根据权利要求1所述的一种日中性工业大麻的花型逆转微繁方法，其特征在于，步骤二中所述培养环境为保持16h光照、8h黑暗的光周期，温度控制在25℃。
4.根据权利要求1所述的一种日中性工业大麻的花型逆转微繁方法，其特征在于，步骤三中培养环境为：16h光照、8h黑暗的光周期处理。
5.根据权利要求1所述的一种日中性工业大麻的花型逆转微繁方法，其特征在于，步骤三中灭菌采用体积分数75％的酒精处理45s，然后以体积分数0.5％的次氯酸钠处理30s，最后用无菌水冲洗5次。
6.根据权利要求1所述的一种日中性工业大麻的花型逆转微繁方法，其特征在于，步骤四中所述芽分化培养基为MS培养基，并添加0.5mMNAA。
7.根据权利要求1所述的一种日中性工业大麻的花型逆转微繁方法，其特征在于，步骤四中在愈伤组织培养时使用解剖刀剥离愈伤组织周围分泌的褐色物质。
8.根据权利要求1所述的一种日中性工业大麻的花型逆转微繁方法，其特征在于，步骤五中所述生根培养基为含有4.92μMIBA的1/2MS液体培养基，且将芽在含有质量浓度0.4％IBA的高压灭菌生根粉中浸泡2min。
9.根据权利要求1所述的一种日中性工业大麻的花型逆转微繁方法，其特征在于，步骤六中所述生长室条件为：温度25℃，相对湿度40％?60％，长日照光周期为：16小时光照，8小时黑暗。
技术领域
本发明涉及功能植物繁育技术领域，更具体的说是涉及一种日中性工业大麻的花型逆转微繁方法。
背景技术
工业大麻作为一种多功能植物，因其药用、纺织和工业用途而被广泛种植，大多数大麻品种为雌雄异株的短日照植物，其开花受光周期调控。传统繁殖方法依赖克隆技术，通过茎插条或微繁技术维持母株的营养生长状态，以避免种子种群的异质性。然而，近年来日中性(不受光周期影响)品种的兴起为大麻生产带来了新的可能性，因其不受光周期限制，日中性品种可以在夏季开花，扩大了大麻户外种植的地理范围。在生长季节较长的南部地区，春季早期种植日中性品种可以促进早期收获，从而实现第二次种植，从而提高生产效率。此外，日中性品种的连续种植可以实现错峰收获，有效分配劳动力和基础设施需求，进一步优化生产效率。尽管如此，日中性品种的快速开花特性也带来了克隆繁殖和维持组织培养的挑战，限制了其在育种中的应用。
花型逆转技术为解决这些挑战提供了新思路，通过将开花植物恢复至营养生长状态，可用于提高繁殖效率和维持原种。但是该方法在工业大麻培育上还未有报道实施，限制了其应用发展。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种日中性工业大麻的花型逆转微繁方法，为改进育种和繁殖方法提供新方向。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种日中性工业大麻的花型逆转微繁方法，包括以下步骤：
步骤一：种子灭菌与萌发
选取饱满且健康的工业大麻种子，先浸泡于无菌水中在暗环境下，随后将种子表面灭菌，最后将处理好的种子接种至1/2MS培养基上；
步骤二：体外培养
将接种后的种子置于培养环境中，当植株生长至花序的白色柱头小花从顶芽中出现时，将其转移至DKW培养基中；
步骤三：花逆转处理
使用锋利的解剖刀和精细镊子将花序作为花外植体进行解剖，取雌花上的苞片灭菌后随即放入DWK培养基中进行培养；
步骤四：愈伤组织的形成
在花外植体培养至观察到花伤口部位开始形成愈伤组织，将愈伤组织在DWK培养基中继续培养7天，之后将愈伤组织转移至芽分化培养基；
步骤五：芽分化的形成
在芽分化培养基中培养至分化的芽长至约5cm时，将其移至生根培养基中；
步骤六：生根与驯化
将生根培养基放置在温度为25℃、光周期为16h光照、8h黑暗、光强度为30μmols?1m?2的环境下，培养21天后，将已形成可见根的芽外植体转移至生长室条件下，将植物保持在长日照光周期下，经过60天的培养，植株发育为完全成熟的植物。
优选的，步骤一中无菌水中浸泡48h，种子表面灭菌采用质量分数10％的次氯酸钠溶液表面灭菌15min，灭菌完成后无菌水冲洗三次。
优选的，步骤二中所述培养环境为保持16h光照、8h黑暗的光周期，温度控制在25℃。
优选的，步骤三中培养环境为：16h光照、8h黑暗的光周期处理。
优选的，步骤三中灭菌采用体积分数75％的酒精处理45s，然后以体积分数0.5％的次氯酸钠处理30s，最后用无菌水冲洗5次。
优选的，步骤四中所述芽分化培养基为MS培养基，并添加0.5mMNAA。
优选的，步骤四中在愈伤组织培养时使用解剖刀剥离愈伤组织周围分泌的褐色物质。
优选的，步骤五中所述生根培养基为含有4.92μMIBA的1/2MS液体培养基，且将芽在含有质量浓度0.4％IBA的高压灭菌生根粉中浸泡2min。
优选的，步骤六中所述生长室条件为：温度25摄氏度，相对湿度40％?60％，长日照光周期为：16小时光照，8小时黑暗。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种日中性工业大麻的花型逆转微繁方法，具有如下有益效果：
本发明的技术方案填补了日中性工业大麻繁殖技术的空白，为工业大麻产业的可持续发展奠定基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1的培养过程图；
图1
图中，A.苞片灭菌培养，B.苞片形成愈伤组织，C.愈伤组织分化出花芽，D.花芽伸长后生根E.移栽。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
日中性工业大麻的花型逆转微繁方法，包括以下步骤：
步骤一：种子灭菌与萌发
选取饱满且健康的工业大麻种子，先浸泡于无菌水中在暗环境下培养48h，随后将种子置于10％次氯酸钠溶液中进行表面灭菌15min，灭菌完成后立即用无菌水冲洗种子三次，彻底去除残留的次氯酸钠，最后将处理好的种子接种至1/2MS培养基上，为种子萌发提供适宜的营养环境；
步骤二：体外培养
将接种后的种子置于培养环境中，保持16h光照、8h黑暗的光周期，温度控制在25℃，当植株生长至花序的白色柱头小花从顶芽中出现时，将其转移至DKW培养基中；
步骤三：花逆转处理
使用锋利的解剖刀和精细镊子，小心地将花外植体成对进行仔细解剖，解剖后取雌花上的苞片，采用体积分数75％的酒精处理45s，然后以体积分数0.5％的次氯酸钠处理30s，最后用无菌水冲洗5次灭菌后随即放入DWK培养基中进行培养，并维持16h光照、8h黑暗的光周期处理；
步骤四：愈伤组织的形成
在花外植体培养14天时，可观察到花伤口部位开始形成愈伤组织，此时，将愈伤组织在DWK培养基中继续培养7天，使其进一步生长和稳定，之后将愈伤组织转移至芽分化培养基，该培养基为MS培养基，并添加0.5mMNAA，以促进愈伤组织向芽的分化；
步骤五：芽分化的形成
在愈伤组织培养过程中，使用解剖刀轻轻剥离愈伤组织周围分泌的褐色物质，避免其对芽生长的不利影响，愈伤组织在芽分化培养基中培养至14天时，观察到有分化的芽开始出现，当分化的芽长至约5cm时，将其移至生根培养基中，生根培养基为含有4.92μMIBA的1/2MS液体培养基，为生根提供必要的激素环境，随后，将芽在含有质量浓度0.4％IBA的高压灭菌生根粉(市售)中浸泡2min，进一步增强根的发育能力；
步骤六：生根与驯化
将每个培养容器放置在温度为25℃、光周期为16h光照、8h黑暗、光强度为30μmols?1m?2的环境下，培养21天后，将已形成可见根的芽外植体转移至生长室条件下，在生长室中(温度25℃，相对湿度40％?60％)，将植物保持在长日照光周期下(16小时光照，8小时黑暗)，经过60天的培养，植株发育为完全成熟的植物。
培养过程如附图1所示。
实验例
以实施例1的方法，设置四组实验，具体过程和数据如下：
培养基1?4中具体操作为：
苞片接种：选取50枚花苞，用解剖刀和镊子分割后变成100枚苞片，将其接入DWK培养基中；
愈伤组织诱导：培养后统计苞片成功诱导出愈伤组织的数量(枚)；
花芽分化：愈伤组织进一步分化形成花芽，分化情况呈现多样性，单个愈伤组织分化出花芽数量在1至3个不等，最终统计分化产生花芽总个数；
花芽伸长监测：对每个花芽的生长状态进行持续监测，在后续生长进程中，确认成功伸长的花芽个数；
生根诱导：将伸长的花芽转入到生根培养基中，进行生根诱导，生根培养结束后观察统计，统计成功生根花芽个数。
结果如下表：
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
文章摘自国家发明专利，一种日中性工业大麻的花型逆转微繁方法，发明人：唐立郦，程莉莉，刘丹丹，杨洌，袁红梅，张文洁，樊超，康庆华，宋喜霞，姜卫东，姚丹丹，闵凡祥，武琳琳，杨璐，申请号：202511265228.8，申请日：2025.09.05
