摘 要：汉麻中大麻素具有丰富的药理活性，汉麻橄榄醇合酶（CsOLS）基因是催化合成大麻素前体物质橄榄酸（OA）合成的关键酶。为进一步研究CsOLS基因的表达调控，克隆CsOLS基因的启动子序列（CsOLSp），生物信息学分析其转录起始位点（TSS）和顺式元件；克隆约500bp的CsOLSp截断片段CsOLSp1、CsOLSp2、CsOLSp3，构建诱饵载体，转化酵母细胞及自激活检测。以汉麻雌株花、叶等组织构建的cDNA文库为材料进行酵母单杂交筛库，对获得的转录因子进行一对一互作验证，结构域分析和分子对接分析。结果表明，克隆获得1500bp的CsOLSp启动子，包含多种激素响应元件、光响应元件及转录因子结合位点。自激活检测表明CsOLSp1和CsOLSp3可进行后续酵母文库筛选。经初筛与复筛，分别获得与CsOLSp1和CsOLSp3互作的蛋白数量为5，7个，其中转录因子各一个，分别为CsAHL14和CsAHL15。一对一互作验证结果表明，CsAHL14可与CsOLSp1发生互作，CsAHL15可与CsOLSp3发生互作。结构域分析显示，CsAHL14属于AHL家族B类成员，而CsAHL15属于AHL家族A类成员。分子对接分析结果表明，CsAHL14与TTATTTTTTAT序列具有较强的结合能力。推测转录因子CsAHL14可能通过特异性结合CsOLSp启动子中的TTATTTTTTAT顺式作用元件参与CsOLS基因的表达调控，在汉麻大麻素生物合成过程中发挥重要作用。
关键词：汉麻；CsOLS基因；启动子；酵母文库筛选；转录因子
汉麻(Cannabis sativaL.)特指Δ9-四氢大麻酚(Δ9-tetrahydrocannabinol，THC）含量在0.3%以下的大麻品种，又称“工业大麻”[1]。在中国的种植、应用历史可追溯至6000a前。汉麻中含有多种天然化合物，目前已分离鉴定出超500种化学成分，如大麻素、酚萜类、黄酮类、甾体类、脂肪酸、生物碱等[2]。大麻素具有丰富的药理活性，如镇痛、抗炎、抗癫痫、抗惊厥、免疫调节等。大麻素是大麻中的次生代谢产物，由帽状茎状腺毛产生，这些腺毛主要分布在雌性花朵上[3]。到目前为止，已鉴定出120种大麻素。大麻素类化合物具有典型的C21萜酚骨架，主要包括THC、大麻二酚（Cannabidiol，CBD）、大麻环萜酚（Cannabichromene，CBC）、大麻萜酚（Cannabigerol，CBG）等11种类型。
大麻素的合成途径主要分为3个步骤：聚酮合成、MEP途径、氧化环化，前体物质OA和焦磷酸香叶酯（Geranyl pyrophosphate，GPP）分别由聚酮合成和MEP生物合成途径提供。基因CsOLS和CsOAC分别编码关键催化酶橄榄醇合酶（Olivetol synthase，OLS）和橄榄酸环化酶（Olivetolic acid cyclase，OAC），催化合成OA[4]。2018年，Tan等[5]通过在大肠杆菌中共同表达OLS和OAC以及与十六烷酰辅酶A（Hexanoyl-CoA）生成所需的β-氧化逆反应所需的模块，成功实现了OA的合成。2023年，Zhang等[6]在酿酒酵母中开发了高效合成CBGA的平台，通过破坏β-氧化途径pox1基因，消除了己酸的消耗，调整OAC和OLS酶的表达水平，增强了OA途径的流量。朱雪雯等[7]鉴定出9个汉麻聚酮合酶（PKSs，CsPKS1～CsPKS9），表明CsPKS1和CsPKS7串联重复，是汉麻中酚萜类化合物合成通路中的OLS。OA是THC、CBD、CBC等大麻素合成过程中的关键中间产物，OLS是参与OA生物合成的关键酶，功能已证实，但关于其上游启动子及与之相互作用的转录因子的研究鲜有报道
基因表达的调控在很大程度上依赖于其上游启动子区域及与之结合的转录因子。转录因子通过与启动子中的顺式作用元件特异性地相互作用，调节基因的转录活性。酵母单杂交系统作为一种高效的转录因子筛选方法，已在诸多植物研究中取得成功应用，如Fu[8]等通过酵母单杂交系统在紫肉甘薯贮藏根中筛选出7种IbbHLH2启动子的上游结合蛋白，并证实IbERF1和IbERF10是IbbHLH2启动子的关键转录调节因子，参与紫肉甘薯花青素的生物合成；Ma等[9]从茶树（Camellia sinensis）Yinghong 9 cDNA文库中分离出参与咖啡因合成的CsNAC7转录因子，证明其正向调节咖啡因合酶基因yhNMT1并促进茶树咖啡因积累。
本研究将克隆CsOLSp启动子序列，对其进行TSS和顺式作用元件分析。通过酵母文库筛选、一对一回转实验，筛选其上游转录因子，分析转录因子对CsOLS基因的调控作用，为更好开发大麻素生物合成技术、培育高价值汉麻新品种提供理论基础。
1 材料和方法
1.1 CsOLS基因ATG5'端上游1500bp序列的克隆及生物信息学分析
提取汉麻“昶靖园1号”叶片总DNA，在NCBI中搜索汉麻CsOLS基因（XM-030628326.2）ATG5'端上游1500bp序列，利用Primerpremire5.0软件设计上、下游引物,分别为AF（5’-ACAAAGCAGAATAACTCAAAAC-3’）和AR（5’-ATTATTATTATTATTATTATG-3’），将扩增片段命名为CsOLSp。PCR扩增CsOLSp片段，将切胶回收后的片段与pMD18-T载体进行连接，连接后的质粒命名为pMD18-T-CsOLSp,转化大肠杆菌DH5α,进行质粒提取，SphI和EcoRI双酶切鉴定正确后金唯智公司测序。利用BDPG预测分析CsOLSp序列的TSS；PlantCARE在线网站对CsOLSp序列进行顺式作用元件分析。
1.2 诱饵载体的构建
分析CsOLSp序列及载体pAbAi的多克隆位点，设计上、下游引入SacI和HindIII酶切位点的特异引物，将CsOLSp截成3段，设置20bp的重叠区，分别命名为CsOLSp1（520bp）、CsOLSp2（520bp）和CsOLSp3（500bp），如图1所示，扩增引物序列（分别为C1:5’-GGGGAGCTCACAAAGCAGAATAACTCAAAAC-3’、C2:5’-GGGAAGCTTTTTTATATAGAAATTTCAATT-3’、C3:5’-GGGGAGCTCATTGAAATTTCTATATAAAAG-3’、C4:5’-GGGAAGCTTTAATATATTTATTTAAAAAAT-3’、C5:5’-GGGGAGCTCTTTTTTAAATAAATATATTATTA-3’和C6:5’-GGGAAGCTTATTATTATTATTATTATTATG-3’）。使用T4连接酶将扩增的3个片段（CsOLSp1、CsOLSp2、CsOLSp3）分别与双酶切（SacI和HindIII）后的pAbAi载体，16℃过夜连接。将重组载体命名为pAbAi-CsOLSp1、pAbAi-CsOLSp2和pAbAi-CsOLSp3，分别转化大肠杆菌DH5α感受态细胞、质粒提取、双酶切鉴定。
图1 CsOLSp截断示意图
1.3 转化酵母菌、自激活检测
将测序正确的诱饵载体（pAbAi-CsOLSp1、pAbAi-CsOLSp2、pAbAi-CsOLSp3）与p53-AbAi阳性对照载体分别用BstBI单酶切，使其在URA3基因处线性化，参照Coolaber生物公司Y1HGold感受态说明书进行转化酵母感受态。用无菌枪头挑取5个1~2mm大小长势饱满的单克隆至25μL无菌水中，吹打混匀，再加入25μL Matchmarker Insert Check PCR Mix 1，混匀置于PCR仪中。反应结束后电泳检测插入条带大小，条带大小应为1350bp+插入片段长度，鉴定正确的克隆制备成甘油菌于-80℃保存。挑取鉴定正确的Y1HGold单菌落，涂布于含有不同浓度金担子素A（AbA：0，100，200，300，400，600，800，1000ng/mL）的SD/-Ura平板上，根据酵母生长情况，确定文库筛选时AbA的最低使用浓度。
1.4 酵母单杂筛选
酵母cDNA文库为本实验室以汉麻“昶靖园1号”雌株的开花期花、苞片、叶片以及一对真叶展开时的幼叶为材料构建的。参照欧易生物的酵母文库单杂交筛选说明，将次级文库质粒分别转化到制备好的诱饵酵母感受态pAbAi-CsOLSp1、pAbAi-CsOLSp3中，使PEG/LiAc法进行转化，用6mL0.9%NaCl重悬菌液，涂布于SD/-Leu/AbA300平板上，30℃倒置培养3~5d，在相同的培养基上进行二次筛选，挑取单克隆分别接种于3mL的SD/-Leu液体培养基中，30℃摇床培养24~36h，参考Omega酵母提取试剂盒提取酵母质粒。以酵母质粒为模板，以T7-F（5’-TAATACGACTCACTATAGGGC-3’）和3′AD-R（5’-AGATGGTGCACGATGCACAG-3’）为引物进行阳性克隆鉴定，将＞500bp的PCR产物送至生物公司测序。测序结果通过NCBI在线工具上的BLAST进行序列比对分析和功能注释。
1.5 互作克隆的回转验证
根据候选转录因子CsAHL14（XM-030648159.2）和CsAHL15（XM-061103180.1）的CDS序列及载体pGADT7的多克隆位点，上、下游均设计引入EcoRI和BamHI酶切位点的特异引物（分别为H1:5’-GGGGAATTCATGGAACCCAATGAAAACC-3’、H2:5’-GGGGGATCCTTAATCAGGAATTTGATCATAG-3’、H3:5’-GGGGAATTCATGACGAATCGATGGTGGG-3’和H4:5’-GGGGGATCCTCAATAAGGAGGAGGTGG-3’、），T4连接酶将扩增的两个片段分别与双酶切（EcoRI和BamHI）后的pGADT7载体，16℃过夜连接。将重组载体命名为pGADT7-CsAHL14、pGADT7-CsAHL15。将Y1HGold[pAbAi-CsOLSp1]和Y1HGold[pAbAi-CsOLSp3]诱饵菌株分别划线摇菌，制备感受态细胞，采用PEG/LiAc法将构建好的pGADT7-CsAHL14、pGADT7-CsAHL15质粒分别转化制备好的pAbAi-CsOLSp1和pAbAi-CsOLSp3感受态细胞中，待阳性克隆长出后挑取单菌落，于SD/-Leu液体培养基中30℃过夜振荡培养，梯度稀释后，取3μL菌液点样于含300ng/mLAbA的SD/-Leu缺陷型培养基上，根据菌落生长情况确定pAbAi-CsOLSp1和pAbAi-CsOLSp3与候选转录因子是否互作。
1.6 候选转录因子的结构域及分子对接分析
通过在UniProt数据库中检索，共检索到24条汉麻AHL基因编码蛋白的氨基酸序列。陆生植物中的AHL基因通常可分为两类：A类（不含内含子）和B类（含内含子）[10]。利用SMART和MEGA12.0分析CsAHL14、CsAHL15及汉麻AHL家族的结构域。
为验证转录因子CsAHL14与CsOLSp1以及CsAHL15与CsOLSp3的结合能力，采用分子对接方法对其相互作用进行分析。将CsAHL14和CsAHL15的氨基酸序列及相应的小片段启动子序列输入AlphaFold服务器，预测蛋白-DNA复合物结构并保存为CIF文件。利用PyMOL软件对预测结构进行可视化，分析蛋白与DNA之间的氢键作用、关键结合位点及参与结合的氨基酸残基，并对结合界面的局部结构进行精细展示。
2 结果与分析
2.1 CsOLSp序列的克隆及生物信息学分析
以汉麻基因组DNA为模板，PCR扩增1500bp的CsOLSp片段（图2），提取pMD18-T-CsOLSp载体的质粒并进行双酶切鉴定（图2）。测序结果在BLAST网站进行比对，与汉麻ERBxHO40-23品种的相对应序列同源性为99.67%，有5个碱基的差异，可能与品种不同有关。利用BDPG预测分析CsOLSp的TSS，预测值为1（预测值最高）的只有一条序列，为CsOLSp序列中第1450位上的碱基T，因此推测此位置为该启动子的TSS（图3-A）。利用PlantCARE在线网站进行顺式作用元件分析表明，CsOLSp序列含有激素响应元件：CARE（响应GA元件,CAACTC，1个）[11]、P-box（响应GA元件,CCTTTTG，1个）、TGACG-motif（响应MeJA元件,TGACG，1个）[12]；光响应元件：GT1（GRWAAW，3个）、BOX1（TTTCAAA，1个）[13]、BOX4（ATTAAT，5个）[14]；及转录因子的结合位点：WRKY结合位点W-box（TGAC，1个）[15]、DOF结合位点（AAAG，11个）[16]、MYC结合位点E-box（CANNTG，2个）[17]（图3-B）。AHL家族转录因子能够结合AT-rich顺式元件，CsOLSp序列中包含：AATAAYAA[18]、ATATATAT[19]、AATATT[20]、AWDAWAYAWW[21]、WADAWAYAWW[22]、TTWTWTTWTT、TWWTDTTWW[23]顺式元件（图3-C）。
图2 CsOLSp序列的PCR扩增及质粒双酶切结果
图3 CsOLSp序列的TSS和顺式元件分析
2.2 诱饵载体的构建、转化酵母菌
以pMD18-T-CsOLSp质粒为模板,PCR扩增获得分别约500bp的CsOLSp1、CsOLSp2、CsOLSp3片段（图4），分别与双酶切后的pAbAi载体连接，分别获得重组质粒pAbAi-CsOLSp1、pAbAi-CsOLSp2、pAbAi-CsOLSp3，其双酶切鉴定见图4。将线性化的诱饵载体转分别入酵母Y1HGlod感受态中，30℃倒置培养3~5d，菌落PCR产物大小均约为1850bp（图5），说明CsOLSp1、CsOLSp2和CsOLSp3已分别转入载体pAbAi中。
图4 CsOLSp1、CsOLSp2、CsOLSp3片段的PCR扩增及质粒双酶切结果
2.3 自激活检测
挑取上述验证条带正确的诱饵酵母单菌落，分别涂布于含有不同浓度AbA的SD/-Ura平板上，进行AbA梯度浓度抗性筛选（图6）。当抗生素AbA浓度达到200ng/mL的时候，含CsOLSp1和CsOLSp3片段的平板均有少量酵母生长，AbA浓度达到300ng/mL的时候，这两个片段酵母均不能生长，因此，pAbAi-CsOLSp1和pAbAi-CsOLSp3选用300ng/mL的AbA用于后续酵母cDNA文库筛选以及回转验证实验。当抗生素AbA浓度达到1000ng/mL的时候，在含CsOLSp2片段的平板上仍少量酵母生长，说明pAbAi-CsOLSp2仍有自激活，不能进行之后的酵母单杂筛选试验。
图6 诱饵载体自激活检测
2.4 酵母cDNA文库筛选结果分析
基于BLAST比对分析，初步筛选到12个阳性蛋白（去除冗余序列），其中未表征蛋白3个；与CsOLSp1和CsOLSp3互作的蛋白数量及其功能特征见表1，筛选出的阳性蛋白数目分别为5个和7个，其中转录因子各一个，通过比对，分别是汉麻AT-hook基序核定位蛋白14（CsAHL14，XM-030648159.2）和汉麻AT-hook基序核定位蛋白15（CsAHL15，XM-061103180.1），CsAHL14与XM-030648159.2编码氨基酸的同源性为100%，CsAHL15与XM-061103180.1编码氨基酸的同源性为99%（相差一个氨基酸），可能与不同品种有关。二者同为AT-hook转录因子（AHL）。
表1 酵母文库筛库结果
2.5 互作克隆的回转验证
将测序验证正确的阳性克隆质粒pGADT7-CsHL14和pGADT7-CsHL15（图7）分别转化至含pAbAi-CsOLSp1和pAbAi-CsOLSp3诱饵载体的Y1HGold感受态细胞中。结果如图8所示，在添加300ng/mLAbA的SD/-Leu培养基上，阳性对照以及共转化pAbAi-CsOLSp1+pGADT7-CsAHL14和pAbAi-CsOLSp3+pGADT7-CsAHL15的酵母菌株均能够正常生长，而阴性对照菌株不能生长。表明CsAHL14和CsAHL15蛋白分别与CsOLSp1和CsOLSp3启动子序列发生结合，并激活了pAbAi载体中AbAr报告基因的表达，转录因子CsAHL14与CsOLSp1及CsAHL15与CsOLSp3之间存在相互作用。此外，随着酵母菌液浓度的逐渐降低，菌落分布更为稀疏。
图7 CsAHL14和CsAHL15片段的PCR扩增及质粒双酶切结果
图8 一对一回转验证
2.6 候选转录因子的结构域分析
在UniProt数据库中检索到的24条汉麻AHL基因长度介于1098bp至5700bp之间。系统进化树分析结果（图9-A）显示，这24条序列的进化分枝长度整体较短，范围为0.0011~0.3412，表明各序列之间差异较小，进化距离较近。其中，CsAHL14（XP-030504019.1）与XP-030490063.1的亲缘关系最近，序列同源性为29.02%；CsAHL15（XP-060959163.1）与XP-030478724.2的亲缘关系最近，同源性为68.29%。如图9-B所示，所有24条CsAHL蛋白序列均同时含有AT-hook基序和PPC结构域，表明该基因家族在结构组成上具有较高的保守性。如图9-C所示，上部分的13条序列不含内含子，属于A类，包括CsAHL15；下部分的11条序列含有内含子，属于B类，包括CsAHL14。此外，A类CsAHLs只含有一个AT-hook基序；而B类CsAHLsY含有一个AT-hook基序或两个AT-hook基序，本研究中分析的CsAHL14和CsAHL15均仅含有一个AT-hook基序。
图9 汉麻AHLs家族结构域分析
2.7 候选转录因子的分子对接分析
pLDDT（预测局部距离差异置信度）是一种用于反映局部结构预测可靠性的指标。在CsAHL14:DNA和CsAHL15:DNA复合物中，CsAHL14和CsAHL15的AT-hook结构域均表现出较高的pLDDT值（>70），表明该区域的结构预测具有较高可信度（图10-A、B）。如图10-C、D和表2所示，CsAHL14与CsOLSp1中5个保守基序结合时，其最高ipTM（界面拓扑匹配度）值达到0.90，预测为较强结合。该复合物中，蛋白与核酸结合界面各涉及4个氨基酸残基，其相互作用主要由碱性残基与核酸磷酸骨架之间形成的盐桥所主导。相比之下，CsAHL15与CsOLSp3中3个保守基序结合时，其最高ipTM值为0.69，预测为可能结合。该复合物中蛋白与核酸界面各涉及5个氨基酸残基，其相互作用以氢键为主。这些非共价相互作用有助于提高CsAHL14-CsOLSp1及CsAHL15-CsOLSp3复合物的结构稳定性。
图10 CsAHL14和CsAHL15与DNA基序的分子对接分析
表2 蛋白质与核酸序列的对接结果
3 结论与讨论
随着大麻素在医药和生物活性研究领域中的潜在应用价值不断受到关注，汉麻中大麻素的生物合成途径及其调控机制逐渐成为研究热点。目前，相关研究主要集中在大麻素合成关键酶的鉴定与功能解析方面，如Δ9-四氢大麻酚酸合酶（THCAS）[24]、大麻二酚酸合酶（CBDAS）、大麻酚萜酸合酶（CBGAS）[25]及相关修饰酶等。然而，对于大麻素生物合成过程中转录调控网络的研究仍相对薄弱，尤其是关键结构基因上游启动子及其互作转录因子的调控机制尚不清晰。解析基因的转录调控过程，将为调控大麻素生物合成水平、提升其积累量提供重要的理论依据。对CsOLSp启动子的克隆及其顺式作用元件的精细分析，有助于进一步解析该启动子与转录因子之间的互作关系。
本研究通过酵母文库筛选CsOLS启动子上游调控因子，以CsOLSp1和CsOLSp3作为诱饵分别筛选获得5，7个候选蛋白，其中转录因子各1个，筛选数量相对较少，这可能与CsOLSp序列中富含AT序列有关。尽管顺式作用元件预测结果显示CsOLSp中还存在其他转录因子的潜在结合位点，但这些转录因子可能无法与CsOLSp序列有效结合。此外，在CsOLSp1筛选结果中，汉麻L-抗坏血酸过氧化物酶2及一个未表征蛋白分别出现17，7次，推测其可能作为辅助蛋白参与CsOLS基因的表达或调控过程。CsOLSp片段预测的TSS位于1450bp处，-500bp至TSS区域通常属于典型启动子区域，在基因转录起始过程中发挥关键作用[26]；此外，TSS上游-2000~-1000bp区域常含有增强子或调控元件[27]。本研究中，CsOLSp2片段在1000ng/mLAbA浓度下仍表现出自激活现象，可能含有能够在酵母中激活报告基因表达的顺式作用元件，不适合用于后续酵母单杂交文库筛选。本研究进一步分析的CsOLSp1和CsOLSp3片段分别位于预测的TSS上游-1500bp~-1000和-500bp至TSS区域，这两个区域分别具有潜在的远端调控区和核心启动子附近的调控区。AHL家族基因已被证实在植物生长发育及非生物胁迫响应中发挥重要调控作用，已有研究表明，AHL转录因子参与下胚轴和叶柄伸长[28]、花粉壁和花发育[29]、体细胞胚胎发生[30]、根系发育[31]、腋生分生组织发育[32]、提高抗旱能力[33]等过程。此外，AHL家族成员还参与光响应、无氧诱导及赤霉素信号通路[22],并在次生代谢物形成中发挥作用，如过表达CsAHL20可显著下调次生代谢物表儿茶素生物合成关键基因CsANR的表达[34]。CsOLS基因编码催化大麻素前体物质OA合成的关键酶，已有研究表明大麻素生物合成过程受多种激素调控[25,35]。推测AHL家族转录因子可能通过参与激素相关调控网络，对CsOLS基因的表达发挥调控作用。本研究对汉麻AHL家族转录因子进行了系统的结构分析与分类，共鉴定A型13条、B型11条，为后续深入解析汉麻AHL家族功能奠定了基础。有研究表明，分子对接能够指导酵母单杂交（Y1H）、电泳迁移率分析（EMSA）等试验，显示预测出的结合位点与实验验证位点高度一致[36]。本研究中分子对接结果显示，CsAHL14与CsOLSp1中的TTATTTTTTAT序列具有较强的结合能力，而CsAHL15可能与CsOLSp3中的TAAATAAATATATT序列结合。在酵母筛库过程中，CsAHL14被筛选到2次，结合分子对接结果，推测CsAHL14通过与TTATTTTTTAT序列结合，从而调控CsOLS基因的表达。
参考文献:
[1]Sun X P.Research progress on cannabinoids in Cannabis (Cannabis sativa L.)in China[J].Molecules,2023,28(9):3806.doi:10.3390/molecules28093806.
[2]Zhang Z P,Wang Z,Lu J X,Yan S,He L Q,Wang P P,Qin C,Ren W C,Xu J,Wu J L,Liu X B,Ma W.In silico genome-wide analysis of homeodomain-leucine zipper transcription factors in Cannabis sativa L[J].Heliyon,2024,10(7):e28045.doi:10.1016/j.heliyon.2024.e28045.
[3]Deguchi M,Dhir S,Potlakayala S,Dhir S,Curtis W R,Rudrabhatla S.In planta female flower agroinfiltration alters the cannabinoid composition in industrial hemp(Cannabis sativa L.)[J].Frontiers in Plant Science,2022,13:921970.doi:10.3389/fpls.2022.921970.
[4]刘永蓓,张小雨.工业大麻EMS突变体及大麻素合成相关基因表达分析[J].植物遗传资源学报,2025,26(2):394-403.doi:10.13430/j.cnki.jpgr.20240430002.Liu Y B,Zhang X Y.Construction of the EMS mutagenesis library for industrial hemp and expression of genes related to cannabinoid biosynthesis[J].Journal of Plant Genetic Resources,2025,26(2):394-403.
[5]Tan Z G,Clomburg J M,Gonzalez R.Synthetic pathway for the production of olivetolic acid in Escherichia coli[J].ACS Synthetic Biology,2018,7(8):1886-1896.doi:10.1021/acssynbio.8b00075.
[6]Zhang Y F,Guo J L,Gao P Z,Yan W,Shen J F,Luo X Z,Keasling J D.Development of an efficient yeast platform for cannabigerolic acid biosynthesis[J].Metabolic Engineering,2023,80:232-240.doi:10.1016/j.ymben.2023.10.004.
[7]朱雪雯,米要磊,孟祥霄,陈伟强,王思凡,曹雪,陈士林,徐志超,苏畅,孙伟,万会花.汉麻聚酮合酶基因家族成员鉴定与表达分析[J].中草药,2023,54(3):886-897.doi:10.7501/j.issn.0253-2670.2023.03.023.Zhu X W,Mi Y L,Meng X X,Chen W Q,Wang S F,Cao X,Chen S L,Xu Z C,Su C,Sun W,Wan H H.Identification and expression analysis of Polyketide synthase gene family in Cannabis sativa[J].Chinese Traditional and Herbal Drugs,2023,54(3):886-897.
[8]Fu D W,Chen Y H,Gao F.Yeast one-hybrid screening for transcription factors of IbbHLH2 in purple-fleshed sweet potato[J].Genes,2023,14(5):1042.doi:10.3390/genes14051042.
[9]Ma W H,Kang X,Liu P,She K X,Zhang Y Y,Lin X R,Li B,Chen Z Z.The NAC-like transcription factor CsNAC7 positively regulates the caffeine biosynthesis-related gene yhNMT1 in Camellia sinensis[J].Horticulture Research,2022,9(1):3653-3665.doi:10.1093/hr/uhab046.
[10]Peng Y,Guo X Q,FanY W,Liu H,Sun L Q,Liu D,Li H,Wang X,Guo H L,Lu H.Systematical characterization ofthe AT-Hook gene family in Juglans regia L.and the functional analysis of the JrAHL2 in flower induction and hypocotyl elongation [J].International Journal of Molecular Sciences,2023,24:7244-7263.doi:10.3390/ijms24087244.
[11]Peng Y,Guo X Q,Fan Y W,Liu H,Sun L Q,Liu D,Li H,Wang X,Guo H L,Lu H.Identifying a cis-element in PtoCP1 promoter for efficiently controlling constitutive gene expression in Populus tomentosa[J].PeerJ,2024,12:e18292.doi:10.7717/peerj.18292.
[12]张晓红,许佩阳,闫绪,张贝贝,于婵婵.棉花GhFUL1基因及其启动子的克隆和功能分析[J].华北农学报,2023,38(5):60-68.doi:10.7668/hbnxb.20193992.Zhang X H,Xu P Y,Yan X,Zhang B B,Yu C C.Cloning and functional analysis of GhFUL1 gene and its promoter in cotton[J].Acta Agriculturae Boreali-Sinica,2023,38(5):60-68.
[13]Jia H L,Wang X M,Shi Y H,Wu X M,Wang Y Q,Liu J N,Fang Z H,Li C Y,Dong K H.Overexpression of Medicago sativa LEA4-4 can improve the salt,drought,and oxidation resistance of transgenic Arabidopsis[J].PLoS One,2020,15(6):e0234085.doi:10.1371/journal.pone.0234085.
[14]Diao P F,Sun HY,Bao Z,Li W X,Niu N,Li W M,Wuriyanghan H.Expression of an antiviral gene GmRUN1 from soybean is regulated via intron-mediated enhancement (IME)[J].Viruses,2021,13(10):2032-2046.doi:10.3390/v13102032.
[15]W J,Wang Y C,Yu L,Jiang HY,Guo Z W,Xu H F,Jiang S H,Fang H C,Zhang J,Su M Y,Zhan ZY,Chen X L,Chen X S,Wang N.MdWRKY11 participates in anthocyanin accumulation in Red-Fleshed apples by affecting MYB transcription factors and the photoresponse factor MdHY5[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2019,67:8783-8793.doi:10.1021/acs.jafc.9b02920.
[16]Liao B J,Liang P X,Tong L,Lu L,Lu Y,Zheng R H,Zheng X Y,Chen J H,Hao Z D.The role of liriodendron Dof gene family in abiotic stress response [J].Plants,2024,13(14):2009.doi:10.3390/plants13142009.
[17]Liu S C,Wang Y,ShiM,Maoz I,GaoX K,Sun MH,Yuan TP,Li KL,Zhou W,Guo XH,Kai GY.SmbHLH60 and SmMYC2 antagonistically regulate phenolic acids and anthocyanins biosynthesis in Salvia miltiorrhiza[J].Journal of Advanced Research,2022,42:205-219.doi:10.1016/j.jare.2022.02.005.
[18]Dahro B,Wang Y,Khan M,Zhang Y,Fang T,Ming R H,Li C L,Liu J H.Two AT-Hook proteins regulate A/NINV7 expression to modulate sucrose catabolism for cold tolerance in Poncirus trifoliata[J].New Phytologist,2022,235(6):2331-2349.doi:10.1111/nph.18304.
[19]Liu H,Dong S Y,Li M,Gu F W,Yang G L,Guo T,Chen Z Q,Wang J F.The Class III peroxidase gene OsPrx30,transcriptionally modulated by the AT-hook protein OsATH1,mediates rice bacterial blight-induced ROS accumulation[J].Journal of Integrative Plant Biology,2021,63(2):393-408.doi:10.1111/jipb.13040.
[20]Xiong S X,Zeng Q Y,Hou J Q,Hou L L,Zhu J,Yang M,Yang Z N,Lou Y.The temporal regulation of TEK contributes to pollen wall exine patterning[J].PLoS Genetics,2020,16(5):e1008807.doi:10.1371/journal.pgen.1008807.
[21]Shi X W,Yang T,Ren M F,Fu J,Bai J,Cui H C.AT-hook motif nuclear localized transcription factors function redundantly in promoting root growth through modulation of redox homeostasis[J].The Plant Journal,2024,120(1):199-217.doi:10.1111/tpj.16981.
[22]Wang M,Chen B W,Zhou W,Xie L N,Wang L S,Zhang Y L,Zhang Q Z.Genome-wide identification and expression analysis ofthe AT-hook Motif Nuclear Localized gene family in soybean[J].BMC Genomics,2021,22:361.doi:10.1186/s12864-021-07687-y.
[23]Jia Q S,Zhu J,Xu X F,Lou Y,Zhang Z L,Zhang Z P,Yang Z N.Arabidopsis AT-hook protein TEK positively regulates the expression of Arabinogalactan proteins for nexine formation[J].Molecular Plant,2015,8(2):251-260.doi:10.1016/j.molp.2014.10.001.
[24]Liu Y Y,Zhu P P,Cai S,Haughn G,Page J E.Three novel transcription factors involved in cannabinoid biosynthesis in Cannabis sativa L.[J].Plant Molecular Biology,2021,106(1):49-65.doi:10.1007/s11103-021-01129-9.
[25]Fayaz M,Angmo T,Katoch K,Majeed A,Kundan M,Wajid M A,Pal K,Misra P.The promoter regions of CBDAS and PT genes of cannabinoid biosynthesis in Cannabis sativa respond to phytohormones and stress-related signals[J].Planta,2025,261(6):135.doi:10.1007/s00425-025-04709-x.
[26]Hiratsuka T,Makita Y,Yamamoto Y Y.Sequence-based evaluation of promoter context for prediction of transcription start sites in Arabidopsis and rice[J].Scientific Reports,2022,12:6976.doi:10.1038/s41598-022-11169-w.
[27]Haberle V,Stark A.Eukaryotic core promoters and the functional basis of transcription initiation[J].Nature Reviews Molecular Cell Biology,2018,19(10):621-637.doi:10.1038/s41580-018-0028-8.
[28]Favero D S,Kawamura A,Shibata M,TakebayashiA,Jung J H,Suzuki T,Jaeger K E,Ishida T,IwaseA,Wigge P A,Neff M M,Sugimoto K.AT-hook transcription factors restrict petiole growth by antagonizing PIFs[J].Current Biology,2020,30(8):1454-1466.e6.doi:10.1016/j.cub.2020.02.017.
[29]Lou Y,Xu X F,Zhu J,Gu J N,Blackmore S,Yang Z N.The tapetal AHL family protein TEK determines nexine formation in the pollen wall[J].Nature Communications,2014,5:3855.doi:10.1038/ncomms4855.
[30]Karami O,RahimiA,Mak P,HorstmanA,Boutilier K,Compier M,van der Zaal B,Offringa R.An Arabidopsis AT-hook motif nuclear protein mediates somatic embryogenesis and coinciding genome duplication[J].Nature Communications,2021,12:2508.doi:10.1038/s41467-021-22815-8.
[31]Širl M,Šnajdrová T,Gutiérrez-Alanís D,Dubrovsky J G,Vielle-Calzada J P,Kulich I,SoukupA.At-hook motif nuclear localised protein 18 as a novel modulator of root system architecture[J].International Journal of Molecular Sciences,2020,21(5):1886.doi:10.3390/ijms21051886.
[32]Karami O,Rahimi A,Khan M,Bemer M,Hazarika R R,Mak P,Compier M,van Noort V,Offringa R.A suppressor of axillary meristem maturation promotes longevity in flowering plants[J].Nature Plants,2020,6(4):368-376.doi:10.1038/s41477-020-0637-z.
[33]Wong M M,Huang X J,Bau Y C,Verslues P E.AT Hook-Like 10 phosphorylation determines ribosomal RNA processing 6-like 1(RRP6L1) chromatin association and growth suppression during water stress[J].Plant,Cell & Environment,2024,47(1):24-37.doi:10.1111/pce.14725.
[34]Chen Y,Luo M Y,Li P,Zhao Q,Chao L,Jiao Y J,Tian S Y,Tian X Y,Ye S Y,Yuan Z,Hu Y L,Bai Y Q,Wan Y,Wang D J,Chen W Y,Yao X Z,Lu L T.CsAHL20 negatively regulates epi-catechins biosynthesis under drought stress in Camellia sinensis[J].Plant Science,2025,359:112613.doi:10.1016/j.plantsci.2025.112613.
[35]Kim J,Kim D G,Ha T H,Kim W J,Ryu J,Kim J B,Kim S H.Effect of hormonal treatments on cannabinoid content levels in female Hemp (Cannabis sativa L.) inflorescences[J].International Journal of Molecular Sciences,2025,26(7):3445-3458.doi:10.3390/ijms26073445.
[36]Zhang Y,Song T T,Xia Y X.Transcription factor MaAP-1 regulates conidiation patterns via YAP domain binding to the MaPom1 promoter in Metarhizium acridum: implications for enhancing fungal biocontrol efficiency[J].Pesticide Biochemistry and Physiology,2025,214:106587.doi:10.1016/j.pestbp.2025.106587.
文章摘自：赵艳，杨将，桑莹莹，翟莹，马天意，张梅娟，李珊珊．汉麻CsOLS基因启动子的克隆及上游转录因子的筛选[J/OL]．华北农学报.https://link.cnki.net/urlid/13.1101.S.20260510.1549.002
