摘 要:【目的】明确罗布麻花部香气的物质基础及动态变化规律,推动其花部资源的综合开发利用。【方法】采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用(HS-SPME-GC-MS)技术,对罗布麻品种‘反卷云边’幼蕾期、大蕾期、初花期、盛花期、末花期5个开花时期花被片的挥发性物质进行种类组成与相对含量差异分析,结合主成分分析、聚类分析及香型特征解析等开展系统研究。【结果】研究表明,在罗布麻花5个花期共检测到50种主要挥发性化合物,涵盖醇类、醛类、酮类、酯类、烷烃类等8类物质。其中醛类种类最多(10种),其次为醇类、酯类和烷烃类。3-甲基-1-丁醇、戊醛、己醛等5种化合物为各花期共有成分,但不同花期的优势挥发性物质组成存在明显差异:幼蕾期以酮类为主(74.17%);大蕾期以醇类(38.49%)和酯类(29.72%)为主;初花期以酯类(39.61%)和其他类(31.91%)为主;盛花期以酮类为主(55.90%);末花期则以醛类(29.81%)和其他类(41.65%)为主。香型特征分析表明,罗布麻花幼蕾期至盛花期整体以花香型为主导,且随花期推进,香气由甜美花香逐渐向末花期的清香并伴随一定化学背景气味转变,呈现出明显的动态变化趋势。主成分分析(PCA)和聚类分析结果进一步表明,不同花期样本之间能够实现显著分离,其中末花期与其他花期之间的差异最为显著【结论】明确了罗布麻不同花期挥发性物质的组成特征及动态规律。
关键词:罗布麻;不同花期;HS-SPME-GC-MS;挥发性物质;
罗布麻(Apocynum venetum)是夹竹桃科(Apocynaceae)罗布麻属(Apocynum)多年生亚灌木,俗称红麻,是我国西北盐碱地、沙荒地典型的生态经济型植物,广泛分布于新疆、青海、甘肃等省区,兼具防风固沙、土壤改良的生态价值与药用、纺织、蜜源植物的经济价值[1-2],其中对罗布麻叶的开发最为深入,叶中富含的黄酮、多糖等化学活性成分具有降压、安神、抗氧化活性等药理作用,被广泛制成罗布麻茶享誉市场[3-4]。
然而,相较于叶片,罗布麻的花朵作为一种极具潜力的特色资源尚未得到充分重视,与同科白麻属(Poacynum)中的白麻(Poacynum pictum(Schrenk)Baill)和大叶白麻(Poacynum hendersonii(Hook.f.)Woodson)不同的是,罗布麻花冠呈紫红色或粉红色,花色更加艳丽多姿,花期长且香气宜人,这不仅是吸引传粉者重要的生态特征,还具有突出的观赏与香精开发潜力[5]。目前对于罗布麻花的研究大多集中于花朵本身的化学成分组成和挥发油提取及工艺等方面,如早期研究中,陈龙[6]、蔡玉鑫[7]等已从罗布麻花中分离鉴定出槲皮素(Ⅱ)、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷(Ⅲ)等活性组分;吕建荣等[8]则以宁夏罗布麻鲜花为材料开展挥发油提取试验,结果表明其挥发性物质的含量与组分特征会随产地、样品前处理方式的不同呈现明显差异。但随着香气植物的发展,越来越多的人把研究焦点聚集在不同花期对香气成分的分析和利用上,如茉莉花不同开放阶段香气成分动态变化的研究,明确了其特征香气物质的释放规律[9];含笑花不同花期挥发性成分的分析,为其种质改良与商业应用提供了依据[10];紫藤鲜花在不同花期的香气成分研究,则推动了其香精资源的开发利用[11]。而关于罗布麻不同开花时期挥发性物质种类与相对含量差异分析的报道缺乏,这直接影响罗布麻花的最佳采收期与资源的最大化利用,因此系统解析罗布麻不同开花时期花香气成分对于指导其生产和实践具有重要意义。
‘反卷云边’是近年选育出来的罗布麻特色品种,其花瓣边缘反卷、花色艳丽,且花期香气浓度显著高于普通罗布麻品种,该香气特征经合作单位多年野外资源调查验证,是其核心种质优势,因此对其香气品质特征的研究具有重要意义。为此,本研究以罗布麻品种‘反卷云边’为材料,采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱(HS-SPME-GC-MS)技术,以其花被片为研究对象,分析其幼蕾期、大蕾期、初花期、盛花期、末花期5个开花时期的挥发性物质组成与含量差异,明确其不同花期的特征香气物质及动态变化规律,旨在为未来香花型罗布麻花新品种选育、天然香料提取、鲜切花材料开发等领域应用提供科学依据,充分发挥罗布麻花的多元应用价值。
1 材料与方法
1.1 试验材料及其取样
供试材料为罗布麻‘反卷云边’品种,该品种通过实生繁殖选育获得,经多代系统选育并且遗传性状表现稳定。试验所用植株为5年生实生苗,定植于新疆维吾尔自治区巴音郭楞蒙古自治州尉犁县罗布麻资源圃(41°21′30.18′′N,86°17′1.63′′E,海拔76m),该区域属暖温带大陆性荒漠气候,全年平均气温10.1℃,气温年较差36.8℃,年平均降水量43mm,夏季炎热、冬季干冷,降水稀少、蒸发强烈;土壤为沙质土,pH值7.07。圃内植株平均高度137~155cm,平均地径约0.78cm,平均冠幅60~100cm,花枝粗约0.6cm,枝条主干呈红色,花朵密度高,生长健壮且无病虫害。
供试罗布麻花采集于上述资源圃,于2025年6月19日—6月21日上午9:00-12:00时采取‘反卷云边’品种不同花期的花被片,该部位是罗布麻花香气释放的主要器官,也是观赏与香气感知的核心部位,因此选取花被片作为挥发性物质测定的研究材料。
按照试验设计,采用随机采样法分别采取罗布麻‘反卷云边’品种5个关键开花时期的样本,采样覆盖花朵从分化到衰老的完整生命周期,确保能系统捕捉挥发性物质的动态变化规律。每个样本3个生物学重复,每个重复0.5g。采样部位为植株树冠外围、枝条中上部健康花被片,随机选取长势一致、无病虫害的植株,从不同方位采集后混合为一个重复。各花期依据以下形态特征进行采样界定(图1):幼蕾期花蕾狭长,长度约6~7mm,体积最小,花瓣紧密包裹呈浅粉色;大蕾期花蕾饱满膨大,长度约8~9mm,花瓣闭合且颜色加深;初花期花瓣初展,花冠直径约10~11mm,边缘反卷特征显现,繁殖器官逐渐暴露;盛花期花瓣完全展开,花冠直径约10~12mm,反卷形态特征最为典型,花色艳丽且雄雌蕊活力最盛;末花期花瓣萎蔫,花冠直径较盛花期缩小约30%~40%,花部结构衰老,繁殖功能衰退。将采集后的样本放置于10mL离心管中密封后立即液氮速冻,利用干冰运送至西北农林科技大学科研实验室,储存于-80℃超低温冰箱,用于罗布麻花不同花期挥发性物质的测定。
图1 罗布麻‘反卷云边’不同开花时期对比图
1.2 顶空-固相微萃取(HS-SPME)分析
将固相微萃取纤维头在气相色谱仪的进样口250℃下老化30min,同时取0.5g样品用液氮研磨后迅速放入20mL螺纹口透明顶空瓶内,加入5ml饱和食盐水充分振荡,用于盐析效应提升目标物质的顶空浓度,以提高检测灵敏度。然后40℃平衡15min,将老化好的固相萃取头插入密闭的样品瓶顶空部分,萃取头固定于样品上方1cm处,40℃下顶空吸附20min。吸附完成后立即将固相微萃取头抽回,插入岛津GCMS-2010SE气相色谱—质谱联用仪GC进样口,解吸附3min,然后进行GC-MS分析。
1.3 气相质谱-色谱联用仪(GC-MS)分析
色谱程序:色谱柱为DB-5ms(30m×0.25mm×0.25μm)弹性石英纤维毛细管柱;以高纯度氦气(99.999%)为载气,进样方式为不分流,总流量为24.8mL/min,进样口温度250℃。采用程序升温模式,初始温度为40℃,维持3min,以5℃/min升至150℃,维持0min,后以10℃/min升至220℃,维持10min。
质谱程序:电离方式EI,电子能量为70eV,离子源温度为240℃,接口温度为240℃,四极杆温度240℃。质谱采用全扫描模式,质量扫描范围为35~500amu。
1.4 花香成分的初步定性和相对定量分析
经GC-MS分析获得各挥发性物质的质谱数据,与NIST标准谱库进行检索定性,本研究为基于谱库检索的初步鉴定,仅选取匹配度>85%的高可信度组分,同时手动核对质谱碎片离子特征、特征离子丰度比例并且分析裂解规律以保障定性结果的可靠性。受试验条件和样品的限制,本研究未开展保留指数测定及标样验证试验,无法完全排除同物异构体的干扰,后续研究将通过标准品进一步确认关键香气活性成分的定性结果。
本研究采用面积归一法确定各挥发物质的相对含量(无内标物参与),计算公式为:组分占比(%)=(单一组分峰面积/所有组分总峰面积)×100。该方法适用于不同样品间挥发性成分相对比例的比较分析,可直观反映不同花期香气成分的组成差异。
1.5 数据分析
各色谱峰对应质谱图经人工解析,采用IBM SPSS Statistics26和Excel 2021进行数据处理,采用Origin 2024进行绘图和分析。主成分分析(PCA)用于筛选关键差异挥发性物质、明确不同花期样本的聚类特征;聚类分析采用Q型聚类(基于样本间距离),用于直观呈现不同花期挥发性物质组成的相似性与差异性。
采用单因素方差分析(One-way ANOVA)检验不同花期挥发性物质(类别及关键成分)相对含量的差异显著性,若存在显著差异(P<0.05),采用Duncan多重比较法进行组间两两比较,显著性水平设为α=0.05。
2 结果与分析
2.1‘反卷云边’不同花期花被片主要挥发性物质差异分析
采用HS-SPME和GC-MS技术分析测定罗布麻5个不同开花时期花被片挥发性物质组成成分及相对含量,共检测出50种主要挥发性物质,可分为8类,包括醇类(7种)、醛类(10种)、酮类(4种)、酯类(7种)、烷烃类(7种)、硅氧烷类(5种)、萜烯类(6种)、其他(5种),其中醛类种类最多,醇类、酯类、烷烃类次之,表明罗布麻‘反卷云边’不同开花时期花被片的挥发性成分种类存在显著差异(表1)。通过对比相对含量发现,幼蕾期(S1)主要挥发性物质集中在酮类(74.17%),其中苯乙酮相对含量(73.84±2.892)显著高于其他花期(P<0.05),是该时期的优势挥发性成分;大蕾期(S2)主要挥发性物质集中在醇类(38.49%)和酯类(29.72%),相对含量显著高于S1、S4、S5时期(P<0.05),分别以乙醇(22.42±1.182)、乙酸-2-苯乙酯(21.24±3.844)为主;初花期(S3)主要挥发性物质集中在酯类(39.61%)和其他类(31.91%),分别以乙酸-2-苯乙酯(30.26±0.718)和苯(30.32±0.335)为主;盛花期(S4)酮类相对含量(55.9%)显著高于S2、S3、S5期(P<0.05),以苯乙酮(47.72±1.846)的相对含量最多;末花期(S5)主要挥发性物质集中在醛类(29.81%)和其他类(41.65%),其中苯(36.71±2.968)的相对含量最多(表2)。其中,3-甲基-1-丁醇、戊醛、己醛、八甲基环四硅氧烷、十二甲基环六硅氧烷这五种挥发性成分为罗布麻不同开花时期的共有挥发性物质(表3)。
从成分动态变化来看,酯类的波动幅度最大:从幼蕾期的4.23%升至初花期的39.61%,盛花期骤降至0.49%,末花期则未检出;醇类呈现“先升后降、大蕾期为峰值、盛花期、末花期保持稳定”的变化规律,幼蕾期相对含量为11.7%;进入大蕾期后显著攀升至38.49%,初花期回落至8.91%,盛花期微升至17.96%,末花期稳定在16.43%。醛类呈现“先升后降再剧增”的趋势,末花期(29.81%)相对含量较盛花期(5.04%)提升近6倍;酮类则在幼蕾期(74.17%)与盛花期(55.9%)分别达到峰值。此外,烷烃类、硅氧烷类、萜烯类等成分的相对含量整体较低(≤3%),且在部分时期(如盛花期的烷烃类、末花期的萜烯类)未检出,表明这些类别对这些花期挥发性物质的整体特征贡献较小。在其他类别的挥发性物质中,苯在初花期和末花期中的相对含量最高,分别是30.32%和36.71%,N-苯基甲酰胺在盛花期中相对含量高,为19.58%。综上,表明不同挥发性物质种类在罗布麻‘反卷云边’不同开花时期呈现不同的动态变化。
表1 罗布麻‘反卷云边’不同开花时期花被片的挥发性物质含量
注:“—”表示未检测出;同行数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05),相同字母表示差异不显著(P>0.05);数据为平均值±标准差(n=3),下同。
表2 罗布麻‘反卷云边’不同开花时期花被片挥发性物质种类的相对含量
表3 罗布麻‘反卷云边’不同开花时期花被片挥发性物质共有成分相对含量差异比较
2.2 ‘反卷云边’不同花期花被片主要挥发性物质主成分分析
为比较幼蕾期、大蕾期、初花期、盛花期和末花期5个不同时期花被片主要挥发性物质特征差异,从50种主要挥发性物质中选取综合贡献前15的物质进行主成分分析(PCA),结果如图2所示:第一主成分(PC1)方差解释率为70.3%,第二主成分(PC2)为26.9%,累计解释率达97.2%,表明这15种主要挥发性物质对罗布麻花被片的香气特征贡献很大。
从样本分布可见:‘反卷云边’不同花期样本呈现明显的组内聚集与组间分离特征。其中,盛花期(S4)样本主要分布在PC1负轴区域、苯乙醇为主要香气影响物质;末花期(S5)样本主要分布在PC1正轴区域,主要香气影响物质有“八甲基环四硅氧烷”、“戊醛”、“己醛”、“1-辛烯-3-醇”等挥发性物质;幼蕾期(S1)、大蕾期(S2)、初花期(S3)样本则集中在PC1负轴区域,主要香气影响物质有“水杨酸甲酯”、“(E)-2-壬烯醛”、“六甲基三环硅氧烷”等挥发性物质。这些结果表明,罗布麻‘反卷云边’花被片的挥发性物质组成随花期推进特征差异明显。
图2 罗布麻‘反卷云边’不同开花时期花被片挥发性物质主成分分析双图
2.3 ‘反卷云边’不同花期花被片主要挥发性物质香型特征分析
香气特征由挥发性组分及含量共同决定,为进一步描述气味特征,可以将具有相似气味的化合物归为一类。基于ChemicalBook权威数据库中各化合物的香味描述与香型标注,结合学界公认的植物经典香气成分关联结论(如苯乙醇对应玫瑰香、乙酸-2-苯乙酯对应玫瑰蜂蜜香等),对检测到的50种挥发性物质进行香型归类,共划分出9种香味类型,包括花香型、果香型、清香型、化学型、香料型、草药香型、木香型、脂香型和蜡香型(表4和图3)。
对罗布麻‘反卷云边’品种五个开花时期的花被片挥发性物质香型特征进行分析发现,其香气构成以花香型为主导,并在不同时期呈现出动态变化规律。如表4所示,苯乙醇、苯甲醇、苯乙酮及乙酸苯甲酯等关键花香型成分在S1至S4时期持续检出,是构成其主体玫瑰甜香与浓香气息的主要来源;而乙酸2-苯乙酯(具玫瑰蜂蜜香)在S1-S3时期出现,进一步丰富了花香的层次。进入末花期S5后,上述多数花香成分消失,同时甲基丙烯醛(野生风信子叶材香)被检出,标志着花香特征减弱并转向青香与木质调。此外,清香型成分(如己醛、3-甲基丁醛)在全部时期稳定存在,尤其在S5时期新增1-辛烯-3-醇与1-戊烯-3-醇,增强了青草与泥土气息;化学型(如各类硅氧烷、戊醛)与蜡香型(如正构烷烃)则在各时期广泛分布,构成了香气的背景基调。
整体上,‘反卷云边’的香气演进表现为从早期(S1-S4)以甜美花香为核心,逐渐过渡至末期(S5)花香减弱、青香与化学背景气味凸显的过程。本研究检测到的苯乙醇、乙酸-2-苯乙酯、苯乙酮等均为植物花香的经典活性成分,其在S1-S4时期的持续检出与相对积累,从物质层面直接印证了该品种花期具香气的种质特征,也为其香气属性提供了明确的化学依据。
表4 罗布麻‘反卷云边’不同开花时期挥发性物质香型特征
图3 罗布麻‘反卷云边’不同开花时期挥发性物质气味类型雷达图
2.4 ‘反卷云边’不同花期花被片主要挥发性物质聚类分析
本试验采用Q型聚类方式,度量标准为欧氏距离的平方,将各开花时期主要花香成分的相对含量数据进行标准化处理后,通过组间连接的方式,以罗布麻‘反卷云边’的50个挥发性物质作为变量,对5个不同花期的挥发性物质进行分层聚类分析(图4)。
结果表明,横向聚类将主要花香成分划分为多个组群,同一组群内的成分在不同开花时期的相对含量变化模式具有相似性,如部分萜类成分(如β-红没药烯、(-)-香橙烯等)聚为一组,这类成分在幼蕾期(S1)相对含量较高,而在其他时期含量降低。纵向聚类对不同开花时期进行归类,体现出时期之间花香成分整体特征的关联程度。五个花期根据挥发性物质组成的相似性被分为三个主要簇。盛花期(S4)与幼蕾期(S1)首先聚为一类,表明二者在主要挥发性物质的组成上最为相似。随后,大蕾期(S2)与初花期(S3)聚为一类。末花期(S5)则与其他所有时期差异最大,在聚类树中单独成支。热图颜色直观反映了各物质在不同时期的相对含量高低。大蕾期与初花期中苯乙醇、苯甲醇、苯乙醛、乙酸苯甲酯、水杨酸甲酯等物质在此阶段相对含量最高。幼蕾期(S1)和盛花期(S4)苯乙酮相对含量较高,进一步证明了S1-S4是花香最为浓郁的时期。末花期(S5)戊醛、己醛、1-辛烯-3-醇、1-戊烯-3-醇以及甲基丙烯醛的相对含量最为突出,标志着香气特征的彻底转变。
图4 罗布麻‘反卷云边’主要花香成分的不同开花时期的热图分析和层次聚类分析
3 讨论
植物花香是花朵释放的低分子量挥发性次生代谢产物,其组成与含量会随开花进程发生显著变化,在自然界中,花的结构、颜色和气味是吸引传粉者到花朵上的关键因素。虽然花的结构和颜色为近距离传粉者提供了重要信息,但花香既可以作为远距离和短距离的吸引剂,也能作为各种昆虫传粉者的花蜜引导[12-15]。目前已鉴定出2000多种花香化合物[16]。在这些化合物中,酯类、醇类、醛类物质占有很大比例,如牡丹花香成分中萜烯类和醇类含量较高[17],玫瑰花中醇类、酯类和萜烯类化合物是主要香气成分[18]。
本研究采用HS-SPME-GC-MS技术对罗布麻‘反卷云边’不同开花时期挥发性物质进行检测,共检测出了50种主要挥发性物质,其中醛类种类(10种)最多,其次是醇类(7种)和酯类(7种)。此外,前人研究表明,随着花的开放和凋谢,观赏植物挥发性成分的种类和释放量均有显著变化[19-20]。本研究表明,罗布麻‘反卷云边’花挥发性物质的组成及相对含量受花期显著影响。在幼蕾期、大蕾期、初花期、盛花期和末花期,‘反卷云边’的挥发性成分分别有18、26、32、17、20种,其中盛花期主要挥发性物质集中在酮类(55.9%),以苯乙酮(47.72±1.846)的相对含量最多,但与以往研究不同的是,本研究发现初花期挥发性成分种类(32种)最为丰富,其中以酯类物质(39.61%)相对含量最多,这与紫花含笑[21]、菊花[22]、鼓槌石斛[19]等盛花期挥发性成分种类最多的植物香气释放规律有所不同。前人研究表明,植物不同花期挥发性成分种类、相对含量及挥发性成分类型的变化,主要由于植物自身的次生代谢产物变化导致,而这一变化与开花这一生殖过程密切相关,其中环境条件也会产生影响[23],从而推测这一现象可能与罗布麻‘反卷云边’花朵代谢调控的物种特异性有关。
本研究还发现,随着‘反卷云边’开花进程的推进,同一类挥发性物质的相对含量在不同开花时期也随之发生变化。从幼蕾期到末花期的这一开花过程中,酯类物质的相对含量呈现先升高后逐渐降低的趋势,这与笔尖单瓣茉莉花[9]、含笑花被片[10]等植物中观察到的酯类物质的变化趋势一致,但略有不同的是,‘反卷云边’中酯类物质在初花期时相对含量最高,随后末花期急剧下降至无,类似在野生矮牵牛花中发现授粉后乙烯调控甲基苯甲酸酯显著下降至几乎检测不到的水平[24],说明‘反卷云边’中酯类物质的合成可能与花朵初开阶段的特定代谢途径(如酯化酶活性增强)密切相关,并在花器官功能转变后迅速降解。而醛类物质呈现“先升后降再剧增”的趋势,如戊醛、己醛在末花期含量显著提升,而已有研究证明花瓣衰老伴随细胞膜完整性的丧失和脂氧合酶活性上升,从而促进醛类物质生成[25],所以推测‘反卷云边’末花期醛类含量的提升可能与花瓣衰老过程密切相关。
根据PCA主成分分析,发现“戊醛”“己醛”“1-辛烯-3-醇”是盛花期和末花期关键的香气成分,而“水杨酸甲酯”“(E)-2-壬烯醛”是幼蕾期、大蕾期和初花期的主要香气影响物质。而不同香型组成的差异与变化趋势因开放时期差异也表现不同。在幼蕾期至盛花期,花香型相对含量占据绝对优势,清香型作为重要辅助香味稳定存在,果香型(如壬醛、6-甲基-5-庚烯-2-酮)及木香型((-)-香橙烯)、香料型(石竹烯)、草药香型(水杨酸甲酯)偶有出现,整体香气表现为丰富的花香气息。至末花期,花香型成分大幅减少,清香型(19.17%)与化学型(72.1%)占比相对上升,同时果香型仍通过辛醛等成分得以保留。通过对比各时期关键香气成分和香型特征,值得注意的是,“戊醛”“己醛”“1-辛烯-3-醇”在盛花期成为关键差异成分,看似与盛花期花香型相悖,实则标志着花朵生理重心从传粉吸引向衰老防御过渡,这与百合[26]后期挥发物变化规律一致。尽管盛花期整体香型仍为花香型,是因为苯乙酮(47.72%)等花香物质绝对含量仍占主导,而醛、醇类物质贡献了关键的背景基调,恰恰是花朵从成熟峰顶转向衰败的过渡期标志。这一变化揭示‘反卷云边’在盛花期之后,其挥发性香气特征由典型的花香主导型,逐步转化为以清香、化学香为基底,兼具残余果香与特殊草药香型,可见不同花期挥发性物质的优势组分存在显著差异。而聚类热图分析进一步证实了盛花期与幼蕾期的挥发性物质最相似,末花期差异最大,体现了‘反卷云边’不同开花时期挥发性物质含量的差异比较。综上,本研究比较了不同开花时期罗布麻‘反卷云边’花被片的挥发性物质组成及特征香气成分,为罗布麻花的开发利用提供了理论依据。
本研究受到野外采样条件和样品保鲜时效性的限制。在样本采集后需要立即液氮速冻并干冰运输以保留挥发性物质的完整性,因此无法在现场同步开展数量化感官评价。此外,样本送达实验室后已进入前处理与检测阶段,不具备重新开展感官品评的条件,这是本研究在试验设计上存在的客观局限。同时,由于本研究未测定挥发性物质的绝对浓度,暂未开展OAV分析,后续研究可通过标准曲线法测定各成分的绝对浓度,结合嗅觉阈值进一步明确其香气贡献,以更全面地揭示罗布麻‘反卷云边’的香气特征与形成机制。
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文章摘自:赵雪情,赵冰,姜黎.罗布麻不同开花时期挥发性物质差异分析[J/OL].西北林学院学报. https://link.cnki.net/urlid/61.1202.S.20260507.1610.004














