摘 要：本发明公开一种苎麻BnWRKY50基因在增加植物根中镉积累和增强植物耐镉性中的应用，属于植物基因工程技术领域。本发明提出苎麻BnWRKY50基因在增加植物根中镉积累和增强植物耐镉性中的应用，所述苎麻BnWRKY50基因的CDS核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明首次明确了苎麻BnWRKY50基因在镉积累和耐镉性调控中的具体功能，在植物中过表达后具有增强植物耐镉性，显著增加植物根系镉积累量，降低地上部镉积累量。
权利要求书
1.一种苎麻BnWRKY50基因在增加植物根中镉积累和增强植物耐镉性中的应用，其特征在于,所述苎麻BnWRKY50基因的CDS核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述苎麻BnWRKY50基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过上调植物中BnWRKY50基因的表达水平，或提高植物中BnWRKY50基因编码蛋白的含量，实现植物根中镉积累增加和耐镉性增强。
4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述植物包括拟南芥和苎麻。
5.一种扩增权利要求1所述苎麻BnWRKY50基因的引物对，其特征在于，所述引物对的碱基序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
6.一种增加植物根中镉积累和增强植物耐镉性的方法，其特征在于，将权利要求1所述的苎麻BnWRKY50基因导入受体植物中，获得过表达BnWRKY50基因的转基因植物，所述转基因植物根中镉积累量增加和耐镉性增强。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，构建含所述BnWRKY50基因的过表达载体，将所述过表达载体转化至农杆菌，再通过农杆菌介导的花序浸染法将BnWRKY50基因导入受体植物。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述过表达载体为以pEGOEP35S-G418为基础载体,通过同源重组将BnWRKY50基因连接至pEGOEP35S-G418的XbaⅠ与BamHI酶切位点之间得到；扩增用于同源重组的BnWRKY50基因片段的引物对碱基序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
9.根据权利要求6-8任一项所述的方法，其特征在于，还包括：对获得的转基因植物进行筛选鉴定,鉴定采用的引物对碱基序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
10.权利要求1所述苎麻BnWRKY50基因在培育镉污染土壤修复植物品种中的应用。
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种苎麻BnWRKY50基因在增加植物根中镉积累和增强植物耐镉性中的应用。
背景技术
镉(Cadmium，Cd)是植物生长过程中非必需的重金属元素，同时也是毒性极强的环境污染物。其在土壤中难以降解且迁移性强，对作物的生长发育造成不可逆的毒害；此外，Cd还能够通过食物链在人体内逐级富集，对人类健康更是构成严重威胁。苎麻(Boehmerianivea L.)是我国特色的多年生韧皮纤维作物，具有根系发达，生长迅速，具有较强的重金属耐受和积累能力，且不进入食物链，被认为是镉污染土壤修复的理想作物。Cd污染土壤修复大田试验表明，苎麻种植4年后土壤Cd含量由1.8mg/kg下降至0.8-1.0mg/kg，下降幅度为44%-55%，湖南省也已将苎麻纳入重金属严重污染耕地产业结构调整相关方案，作为首选修复作物之一。然而，目前缺乏适合修复用的专用苎麻品种，急需培育出纤维产量高、品质优，同时耐镉性强、高积累的苎麻新品种。通过分子育种的方法可加快多年生作物苎麻的育种进程，但目前缺乏可供利用的Cd耐性相关基因，严重影响了Cd污染修复专用品种分子育种工作的开展。
WRKY转录因子(TFs)是植物中最大且最重要的转录因子家族之一，其N端含有一个保守的WRKYGQK结构域，在植物生长发育以及应对生物和非生物胁迫方面发挥着至关重要的作用。大量研究表明WRKY蛋白从重金属Cd的吸收、转运、区隔化、调控螯合剂合成和抗氧化系统等多个维度调控镉的耐受性。PyWRKY71调节活性氧(ROS)的清除，改善植株对镉的抗性、PyWRKY48调节谷胱甘肽(GSH)和植物螯合肽(PC)的表达，增加Cd2+的螯合减轻其毒性；ZmWRKY64、AtWRKY33可调节镉转运蛋白HMA2、NRAMP1的表达,减少Cd的流入提高植物的耐受性。苎麻中还没有对WRKY家族基因在镉胁迫中发挥具体功能的报道。挖掘具有增加镉积累、增强镉耐性的基因对镉修复植物品种的培育具有重要的理论和实践意义。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术不足，提供一种苎麻BnWRKY50基因在增加植物根中镉积累和增强植物耐镉性中的应用，解决现有技术中如何增加植物的镉积累、增强植物的镉耐性的技术问题。
为达到上述技术目的，本发明的技术方案提供一种苎麻BnWRKY50基因在增加植物根中镉积累和增强植物耐镉性中的应用，所述苎麻BnWRKY50基因的CDS核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在任意实施方式中，所述苎麻BnWRKY50基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在任意实施方式中，通过上调植物中BnWRKY50基因的表达水平，或提高植物中BnWRKY50基因编码蛋白的含量，实现植物根中镉积累增加和耐镉性增强。
在任意实施方式中，所述植物包括拟南芥和苎麻。
此外，本发明还提出一种扩增上述苎麻BnWRKY50基因的引物对，所述引物对的碱基序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
此外，本发明还提出一种增加植物根中镉积累和增强植物耐镉性的方法，将上述苎麻BnWRKY50基因导入受体植物中，获得过表达BnWRKY50基因的转基因植物，所述转基因植物根中镉积累量增加和耐镉性增强。
在任意实施方式中，构建含所述BnWRKY50基因的过表达载体，将所述过表达载体转化至农杆菌，再通过农杆菌介导的花序浸染法将BnWRKY50基因导入受体植物。
在任意实施方式中，所述过表达载体为以pEGOEP35S-G418为基础载体，通过同源重组将BnWRKY50基因连接至pEGOEP35S-G418的XbaI与BamHI酶切位点之间得到;扩增用于同源重组的BnWRKY50基因片段的引物对碱基序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
在任意实施方式中，还包括：对获得的转基因植物进行筛选鉴定，鉴定采用的引物对碱基序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
此外，本发明还提出上述苎麻BnWRKY50基因在培育镉污染土壤修复植物品种中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：本发明首次明确了苎麻BnWRKY50基因在镉积累和耐镉性调控中的具体功能，在植物中过表达后具有增强植物耐镉性，显著增加植物根系镉积累量，降低地上部镉积累量。
过表达BnWRKY50的植物在镉胁迫下生长状态显著优于野生型，能有效缓解镉对根系生长的抑制；同时显著提高SOD、POD、CAT等抗氧化酶活性，降低丙二醛(MDA)和过氧化氢(H2O2)含量，减少活性氧积累，增强植物对镉胁迫氧化损伤的防御能力。
过表达BnWRKY50可显著增加植物根系镉积累量，降低地上部镉积累量；非损伤微测试技术证实，转基因植物根系净镉离子内流速度显著提高，同时该基因通过抑制镉转运蛋白基因AtHMA2、AtHMA4、AtNRAMP3和AtNRAMP4的表达,减少镉向地上部转运,实现镉在根系的富集。
对于镉污染土壤修复作物，根中镉含量的增加可提高土壤修复效率，缩短种植修复年限；地上部镉含量的减少，使修复植物的纤维、饲料等产品具备安全利用的可能，扩大了植物的应用范围。
过表达BnWRKY50显著提高植物的耐镉性，使修复植物可种植于重度镉污染区和矿区，提升了植物对镉污染土壤的修复覆盖能力。
本发明提供的BnWRKY50基因为植物镉污染修复分子育种提供了重要的基因资源，构建的过表达载体、筛选鉴定方法为培育耐镉性强、镉高积累的修复植物品种提供了完整的技术体系，在镉污染土壤的植物修复领域具有重大的应用价值和市场前景。
附图说明
图1为本发明实施例1的基因BnWRKY50的扩增结果图。
图1
图2为本发明实施例2带有同源臂的BnWRKY50片段扩增结果图。
图2
图3为本发明实施例2BnWRKY50过表达载体构建结果图。
图3
图4为本发明实施例4过表达BnWRKY50拟南芥的筛选与鉴定结果图，其中，图4中的A为利用G418的抗性筛选结果图，图4中的B为转基因拟南芥的PCR鉴定结果图。
图4
图5为本发明实施例5BnWRKY50基因过表达植株表达量检测结果图。
图5
图6为本发明实施例6镉胁迫下的拟南芥表型图，其中图6中的A为WT与BnWRKY50-OE株系的根长表型观察图，图6中的B为根长、鲜重、根长抑制率的定量分析图。
图6
图7为本发明实施例6土培条件下拟南芥的表型与生理变化图，其中图7中的A为DAB与NBT染色图,图7中的B-G分别为抗氧化酶活性(SOD、POD、CAT)、MDA和H2O2含量以及SPAD值的测定结果图，图7中的H为土培条件下WT和BnWRKY50-OE植株在Cd处理后的表型观察图，上面一行分别为BnWRKY50-OE1(左)和BnWRKY50-OE2(右)株系,下面一行为WT植株。
图7
图8为本发明实施例6拟南芥相关功能基因表达量分析结果图。
图8
图9为本发明实施例7拟南芥镉含量检测结果图。
图9
图10为本发明实施例7拟南芥根系镉流速测定结果图。
图10
具体实施方式
本申请所公开的“范围”以下限和上限的形式来限定，给定范围是通过选定一个下限和一个上限进行限定的，选定的下限和上限限定了特别范围的边界。这种方式进行限定的范围可以是包括端值或不包括端值的，并且可以进行任意地组合，即任何下限可以与任何上限组合形成一个范围。例如，如果针对特定参数列出了60~120和80~110的范围，理解为60~110和80~120的范围也是预料到的。此外，如果列出的最小范围值1和2，和如果列出了最大范围值3,4和5,则下面的范围可全部预料到:1~3、1~4、1~5、2~3、2~4和2~5。在本申请中,除非有其他说明，数值范围“a~b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围“0~5”表示本文中已经全部列出了“0~5”之间的全部实数，“0~5”只是这些数值组合的缩略表示。另外，当表述某个参数为≥2的整数，则相当于公开了该参数为例如整数2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12等。
如果没有特别的说明，本申请所提到的“包括”和“包含”表示开放式，也可以是封闭式。例如，所述“包括”和“包含”可以表示还可以包括或包含没有列出的其他组分，也可以仅包括或包含列出的组分。
如果没有特别的说明，在本申请中，术语“或”是包括性的。举例来说，短语“A或B”表示“A，B，或A和B两者”。更具体地，以下任一条件均满足条件“A或B”：A为真(或存在)并且B为假(或不存在)；A为假(或不存在)而B为真(或存在)；或A和B都为真(或存在)。
本具体实施方式提供了一种苎麻BnWRKY50基因在增加植物根中镉积累和增强植物耐镉性中的应用，所述苎麻BnWRKY50基因的CDS核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述苎麻BnWRKY50基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；通过上调植物中BnWRKY50基因的表达水平，或提高植物中BnWRKY50基因编码蛋白的含量，实现植物根中镉积累增加和耐镉性增强。
在一些实施例中，所述植物包括拟南芥和苎麻。
本具体实施方式还提出一种扩增上述所述苎麻BnWRKY50基因的引物对，所述引物对的碱基序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
本具体实施方式还提出一种增加植物根中镉积累和增强植物耐镉性的方法，将上述苎麻BnWRKY50基因导入受体植物中，获得过表达BnWRKY50基因的转基因植物，所述转基因植物根中镉积累量增加和耐镉性增强；进一步地，在一些实施例中，构建含所述BnWRKY50基因的过表达载体，将所述过表达载体转化至农杆菌，再通过农杆菌介导的花序浸染法将BnWRKY50基因导入受体植物；在一些实施例中，所述过表达载体为以pEGOEP35S-G418为基础载体,通过同源重组将BnWRKY50基因连接至pEGOEP35S-G418的XbaⅠ与BamHI酶切位点之间得到；扩增用于同源重组的BnWRKY50基因片段的引物对碱基序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
在一些实施例中，还包括对获得的转基因植物进行筛选鉴定，鉴定采用的引物对碱基序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
本具体实施方式还提出上述苎麻BnWRKY50基因在培育镉污染土壤修复专用植物品种中的应用。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
在本发明中，涉及到“一些实施例”、“本实施例”以及举例等等，其描述了所有可能实施例的子集，但是可以理解，“一些实施例”可以是所有可能实施例的相同子集或不同子集，并且可以在不冲突的情况下相互结合。
如果申请文件中出现“第一/第二”的类似描述则增加以下的说明，在以下的描述中，所涉及的术语“第一\第二\第三”仅仅是区别类似的对象，不代表针对对象的特定排序，可以理解地，“第一\第二\第三”在允许的情况下可以互换特定的顺序或先后次序，以使这里描述的实施例能够以除了在这里图示或描述的以外的顺序实施。
本实施例中术语“和/或”，仅仅是一种描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如对象A和/或对象B，可以表示：单独存在对象A，同时存在对象A和对象B，单独存在对象B这三种情况。
以下，说明本申请的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本申请，而不能理解为对本申请的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
BnWRKY50基因的获得
将苎麻侧枝进行水培扦插，以生根后培养7天的根为材料。提取根总RNA，以RNA为模版,使用Evo M-MLV Plus cDNA合成试剂盒逆转录为cDNA,扩增体系如下(表1),第一个反应条件为65℃,5min;12℃保存。第二个反应条件为30℃,10min;42℃,60min;95℃,5min;12℃保存。以合成的cDNA为模版，用BnWRKY50扩增引物和高保真酶进行目的基因片段扩增，扩增体系如下(表2),PCR反应条件为94℃ 1min,98℃ 10s,56℃ 5s,72℃ 5s/kb,35Cycles；12℃保存。反应结束后用1%琼脂糖凝胶进行PCR产物电泳检测(图1)。凝胶成像仪显示正确条带后进行切胶回收试剂盒纯化目的片段。
表1 逆转录反应体系
表2 BnWRKY50基因扩增体系
实施例2
过表达载体的构建
选用pEGOEP35S-G418表达载体的XbaI与BamHI两个酶切位点。以SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6为引物扩增获得带有特异性同源臂的BnWRKY50目的片段(图2)，并将其利用同源重组法连接至pEGOEP35S-G418表达载体中，扩增体系如下(表3)。反应条件为50℃15min，12℃保存。重组产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞后，挑取单克隆菌落进行PCR鉴定。琼脂糖凝胶电泳结果显示(图3)，将与预期大小完全一致目的条带的菌液扩大培养送测比对后，提取pEGOEP35S-G418-BnWRKY50重组质粒，将其转化至农杆菌GV3101感受态细胞中，用于拟南芥遗传转化。
表3 载体构建PCR扩增体系
实施例3
过表达拟南芥的的遗传转化
取出GV3101农杆菌感受态细胞置于冰上融化,加入pEGOEP35S-G418-BnWRKY50质粒后轻探混匀,依次在冰上静置5min,液氮5min,37℃水浴5min,冰浴5min。随后加入700μL不含抗生素的无菌YEB液体培养基，混匀后28℃，200rpm复苏2-3h，并均匀涂到YEB固体培养基(含Kan和Rif双抗性)上,28℃倒置培养2~3天。
在1.5mL离心管中加入1mL无菌水并放入适当的野生型拟南芥种子在4℃冰箱放置2天进行春化处理，先用75%酒精清洗1min，再用升汞清洗3min，最后用灭菌水清洗4~5遍后，均匀点播在1/2MS培养基上，长出4片真叶后进行移栽。待拟南芥抽薹开花后，将pEGOEP35S-G418-BnWRKY50过表达载体利用农杆菌介导的花序浸染法进行拟南芥转基因，具体步骤如下：
(1)将测序正确的农杆菌菌液加入到50mLYEB液体培养基(含Kan、Rif)中,28℃,200rpm过夜摇菌。
(2)离心机8000rpm,离心10分钟后收集菌体,弃上清液。配置重悬液(50mL/L MES,2g/L MgC12)重悬菌体,使得OD600值在0.8左右,加入200μM乙酰丁香酮,25℃静置2h。
(3)将拟南芥花序放入侵染液30s~1min，进行24h暗培养后正常培养，一周后再次侵染以提高侵染效率。
(4)待拟南芥成熟后进行分株收种，得到的种子记为T0代。
实施例4
过表达植株的筛选
将T0代拟南芥种子4℃春化后，进行洗种，并均匀点播在1/2MS培养基(20mg/LG418抗生素)上进行筛选，1~2周后选择存活数：死亡数=3：1的株系进行移栽，待幼苗长大后选择性提取几株拟南芥叶片采用CTAB法提取基因组DNA,以SEQ ID NO.7和ISEQ ID NO.8引物对进行PCR验证，测序正确后，确认最终的阳性植株，进行收种记为T1代，结果如图4所示。
实施例5
BnWRKY50基因过表达植株表达量检测
将收获的T1代过表达拟南芥种子继续种植培养至T3代时，以WT作为对照，随机挑取几个过表达株系采用SteadyPure植物RNA提取试剂盒提取拟南芥样品的总RNA，使用逆转录试剂盒SynScript®Ⅲ RT SuperMix for qPCR(+gDNA Remover)逆转录成cDNA,逆转录体系如下(表4)。利用SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10引物对对基因表达量进行检测,以AtActin基因作为内参(SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12),利用ArtiCanATM SYBR qPCR Mix进行qRT-PCR反应,在Bio-Rad CFX96 real-time PCR仪上进行两步法扩增,均设置3个生物学重复,反应体系如下(表5),反应条件为95℃ 1min;95℃ 10s,60℃ 20s,40cycles;72℃ 30s。反应结束后采用2-Δ ΔCt法计算基因的相对表达量。选择两个BnWRKY50表达量显著高于WT的株系,记作BnWRKY50-OE1、BnWRKY50-OE2,结果如图5所示。
由图5可知，BnWRKY50在WT株系中几乎不表达，在T3代过表达转基因株系中表达量显著高于WT。
表4 逆转录反应体系
表5 实时荧光定量PCR反应体系
实施例6
BnWRKY50基因过表达植株耐镉性检测
选取野生型(WT)与获得的转基因BnWRKY50过表达纯合株系拟南芥种子进行春化、清洗消毒、点播于1/2MS固体培养基上，待种子萌发露白后转移至含有0、25、50、75、100μM镉的1/2MS培养基上进行竖直培养2周后用于根长与鲜重的统计分析。另外，将在1/2MS培养基上生长至四叶期的拟南芥幼苗移栽至营养土中，常规培养1~2周后，分别施加0mM、0.5mM、1mM、2mM镉溶液处理,7~10天后进行表型观察,利用SOD、POD、CAT、MDA、H2O2试剂盒进行相关酶活测量，SPAD-502叶绿素含量测定仪(日本柯尼卡美能达)测定叶片SPAD值。同时，选取0.5mM处理的拟南芥叶片用于DAB与NBT组织化学染色，另取该浓度镉处理的拟南芥样品经液氮处理后保存在-80℃冰箱用于RNA提取,分别对AtSOD(SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14)、AtPOD(SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16)、AtCAT(SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18)和AtAPX1(SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20)、AtHMA2(SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22)、AtHMA4(SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24)、AtNramp3(SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26)、AtNramp4(SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28)进行qPR-PCR检测。
由图6可知，50μM镉浓度时拟南芥的根系生长逐渐受到抑制，WT的根长抑制率高达41.23%,而BnWRKY50-OE株系仅为26.13%。但过表达株系的根长(平均约7.39cm)和鲜重(平均每株约8.93mg)分别较WT提高了约24.62%和56.67%。这表明过表达BnWRKY50能够缓解镉对根系生长的抑制作用。
由图7可知,BnWRKY50-OE株系在镉胁迫下的SOD、POD、CAT抗氧化酶活性显著高于WT,分别为WT的1.32倍、1.48倍、1.65倍,SPAD值是WT的1.43倍;但丙二醛(MDA)与过氧化氢(H2O2)含量分别是WT的0.60倍、0.85倍。DAB与NBT染色结果也与酶活测定结果一致，镉胁迫下BnWRKY50-OE株系叶片中过氧化氢(H2O2)和超氧阴离子(02-)的积累明显低于WT。在1mM与2mM CdCl2处理后,WT叶片出现明显黄化和卷曲,而BnWRKY50-OE植株受害症状较轻。
由图8可知,BnWRKY50-OE株系中AtSOD、AtPOD、AtCAT和AtAPX1的相对表达量约是WT的3-4倍，从而增强了拟南芥对氧化损伤的防御能力。相反，BnWRKY50显著抑制了多种镉转运蛋白基因的表达。其中，AtHMA2和AtHMA4的相对表达量分别较WT降低了约50%~70%和60%~70%;AtNRAMP3和AtNRAMP4的表达水平也分别下降了约70%~80%和80%~85%。
以上结果表明，BnWRKY50通过抑制了相关镉转运蛋白基因的表达，从而显著提高了拟南芥对镉胁迫的耐受能力。
实施例7
BnWRKY50基因过表达植株镉含量测定
将经过镉处理后的拟南芥地上部与地下部利用去离子水洗净后充分研磨成细粉，放置105℃烘箱杀青20min，80℃烘干至恒重后采用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)分别测定各株系地上部与地下部的镉含量。采用非损伤微测试技术(NMT)测定拟南芥根部的净Cd²通量。
由图9可知,BnWRKY50-OE株系的根系镉含量相较于WT高了约61.13%,而地上部的镉含量较WT(17.63mg/kg)降低了约35.73%。
由图10可知，转基因拟南芥根系的净镉离子内流速率显著高于WT，平均约为WT的18.1倍。
以上结果表明，转基因BnWRKY50拟南芥植株在根组织中能富集更多的镉，而地上部的镉积累相对较少。
本发明提供的BnWRKY50，在植物中过表达可以降低镉在植株地上部的积累，增加根中镉的积累，增强植株的耐镉性。对于重金属镉修复作物，植株耐镉性的提高，可扩大植物的种植范围到重度污染区和矿区；而根中镉含量的增加，可提高修复的效率，缩短种植修复年限；地上部镉含量的减少，则便于植物用于纤维和饲料等产品的安全利用。因此BnWRKY50基因在植物修复镉污染土壤中将具有重大应用价值。
上述实施例中的序列如下所示：
SEQ ID NO.1基因CDS序列
ATGATGAAGTACCAGCAGAGCTTGTITTGATCAGGAGAGTAATAATATTGATGATCATGATCATGATCAAGATCAAGATCAAGATGTCATCAAACCCCATCACAAATGGGTTTCTTTTCTTTTCTCCAAACAACATGACCCTAATCAATAATCCCCCAATATTGGGATGCCTCAAATCCTTTCCCTCATCATCAACAACAACATACTCAGCCTTGTTCGCTTGTITCCTTTCATAATATCTGATCATCACCACACTTTGCCTTCCCTATCAACAGCAATAATAGTAGCAATAATACTAATAATAATAACCTCTCATCAGAAACTCTTTTAGTCTCATCTCTCTGGGTATTAATAGCAATATTATTCCTTCTAATAACAAGCATAGAGATCAGGACTTCACTACTGCTGTGATTATATTGGAGCTGGAACAACCACAATTCTTTCCTTCGCAAAGATCAACCTCAATCTCTGGGCATGGGGTGAAGTGAGTGGTACTTGCATGGGAAACAAGAGGTTAATTAGTAGTGGGATTAGTAGATTGGCGACGAAGATCATGATAACCATGATAATGATTATGAGGATCATAAACCATAACAATCATATAATCTTCATCATCATCATCATATCATATAATCATATATTGGGGTITTCACAGATGAAGATGAAGAAGATAAAGGGAAGAAGAAAGGTGAGAGAGGCCAAGGTTTTGCTTCAAGACAATGAGCGAAGTGGATGTGCTTGATGATGGATACAAGTGGAGGAAGTACGGACAGAAAGTGGTGAAGAACACACAGCATCCCAAGAGCTATTACCGTTGCACGCAAGATAACTGTCGCGGTGAAGAAACCGGTGGAGCGGTAGCGGAGGACCCGAGGATGGTGATAACGACGTACGAAGGAAGACATGTTCACTCTCCGTCCCACGATTTGGAGACTGATTCACAAGCTCCGTCTCCCTTGAGTAACTTCTTCTGGTAG。
SEQ ID NO.2基因氨基酸序列
TTTISALLPCSLISDHHHTLPSSINNNSNNTNNNLSETLLVSSLGINSNIIPSNNKHRDQDFTTADYIGAGTTQLLSLQRSTSNLWAWGEVSGTCMGNKRLISSGISIGDEDHNDNDYDEDHNHNNHNLLHHHHHNHNHIGVSTMKMKIKGRRKVREPRFCFKTMSEVDVLDDGYKWRKYGQKVVKNTQHPRSYYRCTQDNCRVKRVREALDPRMVITTYEGRHVVSPSHDLETDSQAPSPLSNFFW。
SEQ ID NO.3基因扩增前引物
BnWRKY50-F:ATGATGAAGTACCAGCAGAGC。
SEQ ID NO.4基因扩增后引物
BnWRKY50-R:CTACCAGAAGAAGTTACTCAAGGG。
SEQ ID NO.5基因连接载体扩增前引物
35S-BnWRKY50-F:GAGAACACGGGGGACTCTAGAATGATGAAGTACCAGCAGAGC。
SEQ ID NO.6基因连接载体扩增后引物
35S-BnWRKY50-R:GGACTGACCACCCGGGGATCCCTACCAGAAGAAGTTACTCAAGGG。
SEQ ID NO.7过表达植株验证前引物
35S-F:AGAACACGGGGGACTCT。
SEQ ID NO.8过表达植株验证后引物
NOS-R:ACCGGCAACAGGATTCAA。
SEQ ID NO.9基因表达量检测前引物
BnWRKY50-qF:TCCTCCAAACAACATGACCCT。
SEQ ID NO.10基因表达量检测后引物
BnWRKY50-qR:GGAACAAGGCAACAAGGCTG。
SEQ ID NO.11内参Actin前引物
AtActin-qF:GCACCACCTGAAAGGAAGTACA。
SEQ ID NO.12内参Actin后引物
AtActin-qR:CGATTCCCTGGACCTGCCTCATC。
SEQ ID NO.13基因扩增前引物
AtSOD-qF:AGGAAACATCACTGTTGGAGAT。
SEQ ID NO.14基因扩增后引物
AtSOD-qR:GAGTTTGGTCCAGTAAGAGGAA。
SEQ ID NO.15基因扩增前引物
AtPOD-qF:CGTGCCCTTCATATTGTGG。
SEQ ID NO.16基因扩增后引物
AtPOD-qR:GACGCCATCAACAACGAGTC。
SEQ ID NO.17基因扩增前引物
AtCAT-qF:CTTGTGGTTTCCTGGAATCTACT。
SEQ ID NO.18基因扩增后引物
AtCAT-qR:AGGATCAAECTTGAGGGGTAG。
SEQ ID NO.19基因扩增前引物
AtAPX1-qF:CTCATGGAGCCAACAGTGGT。
SEQ ID NO.20基因扩增后引物
AtAPX1-qR:ACACCAGCAAGCTGATGGAA。
SEQ ID NO.21基因扩增前引物
AtHMA2-qF:AAGATTCGACGGTTTGGGCT。
SEQ ID NO.22基因扩增后引物
AtHMA2-qR:CATCTTCGCAACCACGCAAT。
SEQ ID NO.23基因扩增前引物
AtHMA4-qF:GAGCACGACGCAAAGTTGTT。
SEQ ID NO.24基因扩增后引物
AtHMA4-qR:TGACCAGCAAATGCCAAAGC。
SEQ ID NO.25基因扩增前引物
AtNRAMP3-qF:AAGAAACGAAGAGGAGGACGAT。
SEQ ID NO.26基因扩增后引物
AtNRAMP3-qR:AAAAACCCAGGTCCGGTGAAT。
SEQ ID NO.27基因扩增前引物
AtNRAMP4-qF:TCGTGGCGCTTGTCCTTGA。
SEQ ID NO.28基因扩增后引物
AtNRAMP4-qR:AAGGAGTGGGATCACAGCG。
以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。
文章摘自国家发明专利，苎麻BnWRKY50基因在增加植物根中镉积累和增强植物耐镉性中的应用，发明人:陈平，顾一舟，朱爱国，陈坤梅，高钢，陈佳，王晓飞，陈继康，赵浩含，吴独清，杨桢，颜世伟，申请号:202610408520.9，申请日:2026.03.31。
