摘 要:目的:建立超高效液相色谱-串联质谱法测定火麻啤酒中大麻酚?大麻二酚和四氢大麻酚含量的分析方法?方法:样品经乙酸乙酯提取后,采用水(0.25%甲酸,0.2%甲酸铵)-乙腈进行梯度洗脱,Waters ACQUITY HSS T3色谱柱分离,在电喷雾离子源?多反应监测模式下测定,外标法定量?结果:大麻酚?大麻二酚和四氢大麻酚在1~100ng·mL-1线性关系良好,相关系数r值均大于0.999,在1?10?100ng·mL-1 3个添加水平下,样品回收率为72.9%~106.4%,基质效应为-2.5%~11.3%,准确度为-21.1%~-9.8%,相对标准偏差(Relative Standard Deviation,RSD)中,RSD(日内)为2.3%~11.2%,RSD(日间)为3.5%~14.2%,检出限为0.5ng·mL-1,定量限为10ng·mL-1?结论:该方法操作简便?快速?灵敏度高?前处理过程试剂用量少,可为食品安全监管及公安禁毒执法中非法大麻成分的鉴定提供可靠的技术支持?
关键词:大麻二酚;大麻酚;四氢大麻酚;非法添加
火麻,属桑科大麻属,为一年生直立草本植物,其起源可追溯至锡金?不丹?印度及中亚等地区?在我国,火麻具有悠久的使用历史,被列为“麻?麦?稷?黍?豆”五谷之一[1-2]?火麻茎皮纤维质地坚韧,是制作麻布?纺线?绳索?渔网及纸的优质原料?此外,火麻还具有多种药理功能,包括养护肝肾?延缓衰老?缓解头痛?助眠?抗癌?抗炎和免疫调节等[3]?因具有含油丰富?可食用?药理活性突出等特点,火麻被广泛开发为各类衍生产品,如大麻二酚(Cannabidiol,CBD)保健品?火麻油?火麻啤酒?巧克力?麻仁软胶囊?医用纱布和麻仁饲料等[4-5]?
火麻中大麻素成分包括四氢大麻酚(Δ9Tetrahydrocannabinol,THC)?大麻二酚?大麻酚(Cannabinol,CBN),是其主要的药理活性物质[6]?研究显示,大麻二酚对人类子宫内膜癌Ishikawa细胞具有细胞毒性,可以显著抑制细胞的增殖和迁移能力[7-8];另有研究指出,大麻素对存在阈下失眠症状人群的睡眠质量?失眠症状及健康相关生活质量具有显著改善作用[9]?然而,四氢大麻酚等成分也存在一定的毒性作用,如孕期接触四氢大麻酚可能影响后代的心血管发育[10]?普通人群口服摄入大麻二酚分离物的可接受每日摄入量上限仅为0.43mg·kg-1 bw[11]?临床前模型研究表明,产前大麻素暴露会对后代的学习记忆?行为技能?睡眠及注意力产生负面影响[12]?尤其需要关注的是,四氢大麻酚是火麻中对中枢神经系统作用最强的精神活性成分,具有成瘾性和依赖性,长期使用会成瘾和产生依赖[13]?因此,食品中不得超过工业大麻限量标准添加四氢大麻酚?目前,国际上主要根据四氢大麻酚和大麻二酚的含量及比值区别毒品大麻和工业大麻(THC<0.3%,CBD>0.3%,THC/CBD<1)[14]?
近年来,随着火麻研究的不断深入,其衍生产品逐渐进入人们的日常生活?其中,火麻啤酒颠覆传统啤酒酿造原料,创新性地加入了工业大麻——火麻,广受欢迎?然而,目前市面上的火麻啤酒品质参差不齐,包括国产火麻啤酒和通过跨境电商等渠道流入国内的产品,其四氢大麻酚等精神活性成分的含量缺乏有效监管[15]?更有不法分子非法添加高剂量四氢大麻酚至火麻啤酒中,使消费者产生成瘾和依赖,进而获取暴利,严重威胁消费者健康,甚至可能引发食品安全事件?因此,建立火麻啤酒中四氢大麻酚?大麻二酚?大麻酚成分的检测方法,对于火麻啤酒的安全检测和质量监管具有重要意义?
目前,四氢大麻酚?大麻二酚?大麻酚的常见分析方法包括高效液相色谱法[16-17]?胶体金免疫层析法[18]?气相色谱-质谱联用法[19]?液相色谱-串联质谱法[20-29]?其中,高效液相色谱法灵敏度低,受样品干扰较大,不适合痕量分析;气相色谱-质谱联用法需要对样品进行衍生化处理,该过程中耐酸?耐热性差的大麻素类化合物如大麻二酚可能分解,造成检测结果不准确,且操作烦琐?耗时;液相色谱-质谱联用法不需要衍生化处理,对样品不会造成破坏,耗时短?灵敏度高?准确性高,已成为大麻素类化合物定性定量分析的主流方法?然而,目前尚缺乏针对火麻啤酒中四氢大麻酚?大麻二酚和大麻酚系统分析方法的报道?基于此,本研究基于超高效液相色谱-串联质谱技术建立了火麻啤酒中四氢大麻酚?大麻二酚?大麻酚的分析检测方法,该方法具有较强的实用价值,可为食品安全监管以及公安禁毒领域鉴定非法大麻成分提供重要的方法参考?
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
大麻酚标准品?大麻二酚标准品?四氢大麻酚标准品(1.0 mg·mL-1),上海市刑事科学技术研究院;甲醇?乙醇?乙腈(色谱纯),德国默克公司;异丙醇(色谱纯)?甲酸(质谱纯),赛默飞世尔科技公司;乙酸乙酯(含量≥99.5%),国药集团化学试剂有限公司;甲酸铵(色谱纯),美国希格玛公司;超纯水?
1.2 仪器设备
ACQUITY UPLC/SCIEX 5500三重四极杆液质联用仪,美国Waters公司;ACQUITY HSS T3色谱柱,美国Waters公司;氮吹仪,英国Biotage公司;超声波清洗器,德国埃尔玛公司;离心机,德国赛默飞世尔科技公司;涡旋混合器,广东省科寅实验室设备有限公司;Milli-Q纯水仪,德国默克公司?
1.3 仪器条件
1.3.1 色谱条件
色谱柱:Waters ACQUITY HSS T3(100mm×2.1mm,1.8µm);柱温:40℃;进样量:1µL;流速:0.35mL·min-1;流动相:A为(含0.25%甲酸?0.2%甲酸铵,v/v)水溶液,B为甲醇?梯度洗脱程序:0~4min:60%→95%B;4~6min:95%B;6~6.5min:95%→60%B;6.5~10min:60%B?
1.3.2 质谱条件
电离模式:电喷雾正离子模式;扫描方式:多反应监测模式;气帘气:40psi;碰撞气:9psi;喷雾电压:5 500 V;离子源温度:500℃;喷雾气:35psi;辅助加热气:70psi;碰撞气:氮气;优化后的定性定量离子对的碰撞电压?裂解电压见表1?
表1 3种化合物质谱参数条件
1.3.3 标准溶液的配制
0.1mg·mL-1混合标准溶液:移取浓度均为1.0mg·mL-1的大麻酚?大麻二酚和四氢大麻酚标准溶液各1mL加入10 mL容量瓶中,甲醇定容至刻度线,配制成浓度为0.1mg·mL-1的混合标准物质储备液,密封,-18℃保存备用?
100ng·mL-1标准工作溶液:移取上述0.1mg·mL-1标准物质储备溶液100µL加入10mL容量瓶中,甲醇定容至刻度,摇匀,配制成浓度为1µg·mL-1的标准物质工作溶液;移取1µg·mL-1的标准物质工作溶液1mL加入10mL容量瓶中,甲醇定容至刻度线,摇匀?配制成浓度为100ng·mL-1的标准物质工作溶液,密封,-18℃保存备用?
5ng·mL-1标准工作溶液:移取100 ng·mL-1标准物质工作溶液500µL,加入10mL容量瓶中,甲醇定容至刻度线,配制成浓度为5ng·mL-1的标准物质工作溶液,密封,-18℃保存备用?
1.3.4 样品前处理
取火麻啤酒样品1mL于10mL具塞离心管中,加入4mL乙酸乙酯溶液,涡旋混匀3min,4200r·min-1离心5min后,取上清液至试管中氮吹至近干后加入0.5mL甲醇复溶,过0.22µm滤膜后测定,外标法定量?
2 结果与分析
2.1 色谱条件优化
2.1.1 色谱柱的选择
配制10ng·mL-1含3种目标化合物的样品,分别比较Phenomenex Titank F5(100mm×2.1mm,1.8µm)?Waters ACQUITY HSS T3(100mm×2.1mm,1.8µm)和Agilent Eclipse Plus C18(100mm×2.1mm,1.8µm)色谱柱对3种目标化合物的分离效果,以选择洗脱能力最佳的色谱柱?结果表明,Agilent Eclipse Plus C18色谱柱对3种目标化合物选择性不好,分离能力低于Phenomenex Titank F5与Waters ACQUITY HSS T3色谱柱;与Waters ACQUITY HSS T3色谱柱相比,3种目标物在Phenomenex Titank F5中分离效果较差,具有较宽的峰宽和较差的峰形,即不能提供更高的分辨率和更好的定量结果?因此,后续研究采用Waters ACQUITY HSS T3色谱柱进行?
2.1.2 流动相选择
对比流动相为水(含0.25%甲酸?0.2%甲酸铵,v/v)-甲醇?水(含0.25%甲酸?0.2%甲酸铵,v/v)乙腈?水-甲醇时,3种目标化合物的色谱峰?结果显示,水-甲醇为流动相时,四氢大麻酚色谱峰出现较强的拖尾;水(含0.10%甲酸?0.2%甲酸铵,v/v)-乙腈为流动相时,部分化合物色谱峰有分叉现象,峰形不好;水(含0.25%甲酸?0.2%甲酸铵,v/v)-甲醇为流动相进行梯度洗脱时,色谱峰较对称,峰形较好,结果见图1?
图1 大麻酚?大麻二酚和四氢大麻酚色谱图
2.2 提取方式的选择
以加标阴性样品(10 ng·mL-1)为待测样品进行分析,分别比较直接进样,乙醚?乙酸乙酯作为提取剂对3种目标化合物回收率的影响,结果见图2?采用直接进样进行分析时,3种目标化合物的回收率为56%~65%?这可能是因为火麻啤酒基质较为复杂,直接进样使样品基质效应较强,导致回收率变低?乙醚作为提取剂提取时,3种目标化合物的回收率为58%~74%?采用乙酸乙酯提取时,3种目标化合物的回收率为86%~98%?采用乙酸乙酯提取回收率高于乙醚,可能是因为乙醚极性强于乙酸乙酯,提取过程将基质中的大部分物质转移进乙醚层,导致3种目标化合物的回收率偏低?因此,实验选择乙酸乙酯作为提取剂分析待测物质?
图2 不同提取方式下 3 种化合物的提取回收率
实验进一步比较了乙酸乙酯用量为2?4?6mL时,加标阴性样品中3种目标化合物的回收率?结果显示,乙酸乙酯用量为2mL时3种目标化合物的回收率为68%,用量为4mL和6mL时目标化合物的回收率高于70%?考虑到成本及对环境的影响,选择4mL乙酸乙酯对样品中目标化合物进行提取?
2.3 标准曲线
线性范围?检出限及定量限在阴性火麻啤酒样品中分别添加适量的3种待测目标化合物,使样品中目标化合物浓度分别为1?2?5?10?20?50ng·mL-1和100 ng·mL-1(每个浓度点平行配制3份),上机测定,以目标物定量离子对峰面积为纵坐标,标准添加样品中目标物浓度为横坐标绘制标准曲线,线性回归得到回归方程,见表2?结果显示,在1~100ng·mL-1内,大麻酚?大麻二酚和四氢大麻酚3种目标物的相关系数(r)均≥0.999,线性关系良好?
分别移取若干份阴性火麻啤酒样品,添加系列低于定量限值的3种待测目标化合物,配制低于定量限值的不同浓度的待测样品进行分析?以信噪比(S/N)≥3作为方法检出限,以信噪比(S/N)≥10作为方法定量限,结果见表2?
表2 方法的线性关系?检出限?定量限
2.4 精密度与准确度
分别在空白样品中添加低(1ng·mL-1)?中(10ng·mL-1)?高(100ng·mL-1)3个浓度的混合标准溶液制备待测样品,平行制备6份?当天测定6份平行样品,计算相对标准偏差(Relative Standard Deviation,RSD)评价方法的日内精密度及准确度,其中准确度用偏倚表示?对以上样品平行分析5d,计算RSD评价方法的日间精密度?结果显示,3个浓度水平下,RSD(日内)为2.3%~11.2%,准确度为-21.1%~-9.8%,RSD(日间)为3.5%~14.2%,说明该方法准确度和精密度良好,符合痕量分析要求?3种目标化合物的精密度?准确度结果见表3?
表3 3种目标化合物精密度?准确度
2.5 加标回收率与基质效应
用甲醇将浓度为1000 ng·mL-1的3种待测目标化合物工作溶液分别稀释成浓度为1?10?100ng·mL-1大麻酚?大麻二酚和四氢大麻酚混合标准品溶液,分别重复进样6次,得到浓度均值(A);取6份不同基质的阴性火麻啤酒样品,分别添加适量1 000 ng·mL-1 3种待测目标化合物工作溶液,使其浓度分别为1?10?100ng·mL-1,上机检测,每个浓度平行制备6份进样分析,得到浓度均值(B);取6份不同基质的阴性火麻啤酒样品,提取后浓缩后分别添加适量100ng·mL-1 3种待测目标化合物标准物质工作溶液,使其浓度分别为1?10?100ng·mL-1,上机检测,每个浓度平行制备6份进样分析,得到浓度均值(C)?其中,提取回收率(%)=B/C×100%,基质效应(%)=(C/A-1)×100%?结果显示,提取回收率为72.9%~106.4%,基质效应为-2.5%~11.3%,说明该方法的稳定性好,重现性好,符合痕量分析要求?方法提取回收率与基质效应结果见表4?
表4 方法提取回收率与基质效应
3 结论
本研究首次建立了火麻啤酒中四氢大麻酚?大麻二酚和大麻酚的超高效液相色谱-串联质谱分析检测方法?结果表明,大麻酚?大麻二酚和四氢大麻酚在1~100ng·mL-1线性关系良好,相关系数r值均大于0.999,在1?10?100ng·mL-1 3个添加水平下,样品提取回收率为72.9%~106.4%,基质效应为-2.5%~11.3%,准确度为-21.1%~-9.8%,RSD(日内)为2.3%~11.2%,RSD(日间)为3.5%~14.2%,检出限为0.5ng·mL-1,定量限为1.0ng·mL-1?方法各项参数均满足痕量分析要求,填补了火麻啤酒中大麻酚?大麻二酚和四氢大麻酚检测方法的空白,具有较强的实用价值,可为食品安全监管中非法大麻成分的检测提供参考?
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文章摘自:朱发泽,陈月猛,肖德鑫,等. 超高效液相色谱-串联质谱法测定火麻啤酒中大麻酚?大麻二酚和四氢大麻酚 [J]. 食品安全导刊, 2025, (18): 78-83. DOI:10.16043/j.cnki.cfs.2025.18.037.
