摘 要：本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种剑麻DREB基因及其在提高植物抗寒性中的应用。本发明提供的剑麻DREB基因在低温胁迫后表达水平显著上升，表明其与剑麻应答低温胁迫密切相关。研究发现，通过转基因的方法对剑麻DREB基因进行过表达，随着剑麻DREB基因表达量提高，转基因拟南芥对寒冷的抗性也相应得到提高。在植物内过表达剑麻DREB基因能够提高植物抗寒性，这一发现可用于培育耐寒植物新品种或种苗，为遗传育种提供理论基础及基因资源，对农业生产具有重大意义。
权利要求书
1.剑麻DREB基因或剑麻DREB基因编码的蛋白在提高植物抗寒性中的应用，其特征在于，所述剑麻DREB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述植物为剑麻或拟南芥。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过过表达剑麻DREB基因或剑麻DREB基因编码的蛋白提高植物抗寒功能，所述植物为剑麻或拟南芥。
3.一种提高植物抗寒性的制剂，其特征在于，该制剂的活性成分包括含有权利要求1所述的剑麻DREB基因的重组表达载体或重组农杆菌，所述植物为剑麻或拟南芥。
4.一种培育耐寒植物的方法，其特征在于，所述方法为以下（1）或（2）：
（1）通过提高目的植物中权利要求1所述剑麻DREB基因的表达量，获得耐寒性强于目的植物的植株；
（2）通过增强目的植物中权利要求1所述剑麻DREB基因编码的蛋白的活性，获得耐寒性强于目的植物的植株；
所述植物为剑麻或拟南芥。
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种剑麻DREB基因及其在提高植物抗寒性中的应用。
背景技术
DREB（Dehydration-responsive element binding）基因家族在植物生长调节剂信号通路应答逆境胁迫过程中起重要作用，其编码的蛋白质可特异结合逆境胁迫应答基因启动子区域DRE/CRT（dehydration response element/C-repeat）和G/ACCGAC顺式作用元件。目前已有超过60种植物中报道了DREB基因家族的全基因组分析，已公布的植物基因组逐年增多，使解析DREB基因家族在基因组水平的进化机制成为可能。随着生物信息的逐年增加，探究DREB基因家族调控植物应答逆境胁迫机制对其生物学功能解析具有重要意义。
在拟南芥中开展DREB基因功能鉴定工作较早，目前已解析了多个基因的生物学功能，主要涉及水分胁迫、热胁迫，并参与调控叶片衰老。近年来，随着作物分子生物学研究的深入开展，其它作物中也开展了DREB基因调控逆境胁迫相关研究。例如，OsDREB1C参与调控水稻氮素养分吸收及光合作用，SlDREBA4参与调控番茄应答热胁迫，GmDREB2参与调控干旱胁迫应答。此外，胡杨PeDREB2a可提高转基因拟南芥耐旱和耐盐性，桉树EgrDREB3可增强转基因拟南芥耐盐性。
剑麻（Agave sisalana Perr.ex Engelm.）是一种硬质叶片纤维作物，在热带亚热带地区广泛种植。其用途较为广泛，主要涉及渔业、航海、航天、工矿、运输、油田、纺织等行业。剑麻对高温耐受力较强，但对低温寒害较为敏感，在早春易受“倒春寒”影响，严重时可造成大面积减产。目前剑麻分子生物学研究基础较为薄弱，剑麻抗寒基因相关研究报道较少。
发明内容
本发明的目的在于提供一种剑麻DREB基因及其在提高植物抗寒性中的应用，能够用于提高植物抗寒性和培育耐寒植物。
本发明提供剑麻DREB基因或剑麻DREB基因编码的蛋白在提高植物抗寒性中的应用，所述剑麻DREB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选地，所述植物包括单子叶植物或双子叶植物。
优选地，所述植物包括：剑麻和拟南芥中的一种或多种。
优选地，通过过表达剑麻DREB基因或剑麻DREB基因编码的蛋白提高植物抗寒功能。
本发明还提供一种提高植物抗寒性的制剂，该制剂的活性成分包括含有所述的剑麻DREB基因的重组表达载体或重组农杆菌。
本发明还提供一种培育耐寒植物的方法，所述方法为以下（1）或（2）：
（1）通过提高目的植物中所述剑麻DREB基因的表达量，获得耐寒性强于目的植物的植株；
（2）通过增强目的植物中所述剑麻DREB基因编码的蛋白的活性，获得耐寒性强于目的植物的植株。
本发明的有益效果：本发明提供了一种与植物抗寒性相关的剑麻DREB基因和剑麻DREB基因编码的蛋白，所述剑麻DREB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述剑麻DREB基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。经本发明研究发现，剑麻DREB基因和剑麻DREB基因编码的蛋白能够提高植物抗寒性，用于培育耐寒植物。本发明提供的技术方案能够应用于剑麻抗寒性状品种的遗传育种，为培育耐寒植物新品种或种苗提供理论基础及基因资源。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明提供的剑麻DREB基因琼脂糖凝胶电泳验证结果；其中条带1、2、3均为PCR产物的电泳结果，条带M为Marker；
图1
图2为本发明提供的剑麻DREB基因在剑麻受到低温胁迫后的表达水平，其中*表示p<0.05，**表示p<0.01；
图2
图3为pEGAD-DREB表达载体图谱；
图3
图4为本发明提供的野生型拟南芥（WT）与剑麻DREB基因在拟南芥中过表达后分别在低温处理和对照（正常条件）下的生长情况；其中OE1、OE2和OE3为不同过表达株系；
图4
图5为本发明提供的野生型拟南芥（WT）与剑麻DREB基因在拟南芥中过表达后分别在低温处理和对照（正常条件）下的丙二醛和3种抗氧化酶活性的统计结果，其中OE1、OE2和OE3为不同过表达株系，*表示p<0.05，**表示p<0.01。
图5
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。如无特殊说明，本发明所用到的试剂、方法均为常规试剂、方法。
实施例1 剑麻DREB基因扩增
本发明人提供了一种剑麻DREB基因，其核苷酸序列通过对剑麻的转录组数据库进行测序和分析获得。
以盆栽剑麻苗为实验材料，对其进行6℃低温胁迫处理，分别在胁迫后的0h、6h、12h、18h和24h采集剑麻叶片，通过柱式法RNA提取试剂盒TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit（TaKaRa，日本）提取叶片总RNA，将5个时期RNA样品混合后使用商业化反转录试剂盒反转录获得cDNA。
根据DREB基因核苷酸序列设计特异性引物并进行PCR扩增，特异性引物序列如下：
正向引物：5'-ATGGAAACAACAGCAGCAGC-3'（SEQ ID NO.4）；
反向引物：5'-TCAAATAGAGTAACTCCACAGCGAC-3'（SEQ ID NO.5）。
PCR扩增反应体系（20μL）具体如下：正向引物1μL（10pmol）、反向引物1μL（10pmol）、EasyTaq® PCR SuperMix 10μL、剑麻cDNA（模板）1μL和ddH2O 7μL。
PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s、60℃退火15s、72℃延伸15s，循环30次，72℃终延伸2min。
对PCR扩增产物进行Sanger测序，获得剑麻DREB基因的序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，其中琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，切胶后进行纯化，得到剑麻DREB基因序列。
SEQ ID NO.1：
5'-ATGGAAACAACAGCAGCAGCAGGAACCAACTCCTCCTCCTCCTCCTTCCCTCGCTCCTCGGCGTC AGACGAGGAGGCCTACGCCACGGTGTCGTCCCTGCCCCCGAAGCGCCGTGCCGGGCGCACCAAGTTCCGCGAGACG CGGCACCCCGTGTACAAGGGCGTCCGGCGCCGCAACTCCGACCGCTGGGTCTGCGAGGTCCGCGAGCCCAACAAGA AGTCCCGAATCTGGCTCGGCACTTTCCCGACAGCCGAGATGGCCGCCCGGGCCCACGACGTCGCCGCCATTGCCCT CCGCGGCCGCTCCGCCTGCCTCAACTTCGCCGACTCCGCCTGGCTCCTCCCGGTGCCGGACTCCTCCAGCCCCAGG GACATTCAACGGGCCGCCGCTGCAGCGGCCGAGGCCTTCCGCCCGCCCTCCTCGGAGACTAACGATCAGACTATCG CAGTTGTTCAGACAACGGCGGCCGGCACTGAGACGGGGCGCGTTTCTGATGGCAGTGTGGTGGATGATCAGCCGTT GTTTTTTGAGCATGGGTTGAATTTGGGGATGCAGGGCTACTTCGACATGGCGCAGGGGATGCTGATCGATCCGCCG CCGACGGAGATGATGCCGGATGTCGATGGGGAGAGCGACGGCGAAATGTCGCTGTGGAGTTACTCTATTTGA-3'。
SEQ ID NO.2：
METTAAAGTNSSSSSFPRSSASDEEAYATVSSLPPKRRAGRTKFRETRHPVYKGVRRRNSDRWVCEVR EPNKKSRIWLGTFPTAEMAARAHDVAAIALRGRSACLNFADSAWLLPVPDSSSPRDIQRAAAAAAEAFRPPSSETN DQTIAVVQTTAAGTETGRVSDGSVVDDQPLFFEHGLNLGMQGYFDMAQGMLIDPPPTEMMPDVDGESDGEMSLWSY SI*。
实施例2 剑麻DREB基因表达分析
采用实时荧光定量PCR的方法，设计剑麻DREB基因的特异性定量引物，并选择剑麻PP2A基因（SEQ ID NO.3）为内参基因并设计特异性内参引物（正向引物：5'-CCTCCTCCTCCTTCGGTTTG-3'（SEQ ID NO.6）；反向引物：5'-GCCATGAATGTCACCGCAGA-3'（SEQ ID NO.7））。以盆栽剑麻苗为实验材料，对其进行6℃低温胁迫处理，分别在胁迫后的0h、6h、12h、18h和24h采集剑麻叶片，通过柱式法RNA提取试剂盒TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit（TaKaRa，日本）提取叶片总RNA，使用商业化反转录试剂盒反转录获得cDNA后进行实时荧光定量PCR分析，每个cDNA样品做三个技术重复样，使用得到的CT值采用2-ΔΔCT法进行计算得到剑麻DREB基因的相对表达量，以明确低温胁迫后剑麻DREB基因的表达情况。
特异性定量引物序列如下：
正向引物：5'-CAGTTGTTCAGACAACGGCG-3'（SEQ ID NO.8）；
反向引物：5'-GGATCGATCAGCATCCCCTG-3'（SEQ ID NO.9）。
实时荧光定量PCR反应体系（TransStart Tip Green qPCR SuperMix试剂盒）具体如下：
正向引物0.4μL、反向引物0.4μL、TransStart Tip Green qPCR SuperMix 5μL、剑麻cDNA（模板）0.5μL、0.2μL Reference Dye和ddH2O 3.5μL。
反应程序为：94℃预变性30s；94℃变性5s、60℃退火30s、60℃延伸30s，循环40次。
结果显示：剑麻DREB基因表达水平在低温胁迫后显著上升，并在处理12h达到峰值后逐渐下降（图2）。
上述结果表明：剑麻DREB基因的表达水平在低温胁迫处理后显著上升，与剑麻应答低温胁迫密切相关，在剑麻耐寒育种中具有潜在应用价值，为剑麻新品种培育提供理论依据。
SEQ ID NO.3：
5'-ATGGCGATGCAAGGGCAAGGGATCGATCCGGCGCTGCTCGACGACATCATCGGCAGGCTGCTCGA GGTCCGATCGGCGAGGCCTGGGAAGCAAGTCCAGCTGTCGGAGGCGGAGATCCGCCAGCTCTGCGTCGCGTCGAGG GAGATCTTTCTTCAGCAGCCCAATCTCCTCGAGCTCGAGGCGCCGATCAAAATCTGCGGTGACATTCATGGCCAAT ACAGTGACCTTTTAAGGCTATTCGAATATGGAGGTTTTCCTCCTGCGGCTAATTATTTGTTTTTAGGAGATTATGT GGACCGGGGAAAACAGAGCTTGGAAACAATATGCCTTCTTCTTGCTTATAAGATCAAGTACCCTGAGAACTTTTTT CTTCTGAGAGGAAACCATGAATGTGCTTCTATAAATAGGATATATGGATTTTATGATGAATGTAAGCGTCGGTTTA ATGTGAGATTATGGAAGGTCTTCACTGATTGCTTTAACTGCCTGCCTGTAGCTGCTCTTATAGATGACAAAATATT ATGCATGCATGGTGGCCTTTCCCCAGATCTGTCAAACCTGGACCAGATTAAAAGCATAACTCGTCCTACTGACGTC CCTGACACTGGTTTACTATGTGACCTGCTCTGGTCTGATCCTGGCACTCAAGTTCAAGGGTGGGGAATGAATGATA GAGGGGTTTCATACACTTTCGGTTCTGATAAGGTGTCTGAATTCTTATCAAAGCATGATCTGGATCTTGTGTGTCG TGCGCATCAGGTTGTGGAAGACGGCTATGAGTTCTTTGCAGACAGACAACTCGTCACTATATTCTCAGCACCAAAT TACTGTGGTGAATTTGATAATGCTGGTGCTATGATGAGTGTTGATGAAACCTTAATGTGCTCTTTCCAAATCTTAA AGCCTGCAGAAAAGAAGCCAAAATTTATGATGTCCACAAAAGTATGA-3'。
实施例3 剑麻DREB基因在提高植物抗寒性的应用
3.1 剑麻DREB基因表达载体构建
使用限制性内切酶EcoRI和BamHI对pEGAD表达载体进行双酶切线性化，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后，切胶回收线性化的pEGAD载体片段；将实施例1中获得的剑麻DREB基因与线性化pEGAD载体片段利用T4 DNA连接酶连接，获得pEGAD-DREB表达载体（图3）；通过电转化法（15~20kV/cm，4.5~5.0ms）将pEGAD-DREB表达载体转化至农杆菌GV3101感受态细胞，涂布在含有100mg/L的庆大霉素、50mg/L的利福平和100mg/L的卡那霉素的LB固体培养基，28℃培养箱培养2天后，挑取单菌落进行菌液PCR鉴定，使用剑麻DREB基因特异性引物扩增，筛选阳性克隆。将得到的阳性克隆接种到含有100mg/L的庆大霉素、50mg/L的利福平和100mg/L的卡那霉素的LB液体培养基中，28℃震荡培养24h后，吸取1mL菌液，保存菌种，用于拟南芥转化。
3.2 拟南芥转化
将2mL菌液加入到50mL含有100mg/L的庆大霉素、50mg/L的利福平和100mg/L的卡那霉素的LB液体培养基中，28℃震荡培养至菌液浓度达到OD600值为0.8-1.0。将得到的菌液离心，转速4000rpm，离心5min，弃去上清，菌体用侵染缓冲液重悬至OD600值0.6；其中侵染缓冲液配方如下：蔗糖（5%）、Silwet L-77（0.05%）、乙酰丁香酮（AS）100μmol/L。
选取抽薹一至两周的生长状况良好的拟南芥植株，剪去角果和已开放的花，留下顶端分生组织及花苞，将处理好的花序浸泡在重悬的菌液中1min，然后盖上黑盖子黑暗下培养24h后去掉黑盖子进行光照培养（22℃±2℃,光照强度为100μmol·m-2·s-1）。
3.3 转基因拟南芥植株的筛选与鉴定
在上述拟南芥转化植株生长一个月后，收集转化植株结出的成熟种子。选取颗粒饱满的种子，利用2%次氯酸钠溶液消毒15min，倒出次氯酸钠溶液后用无菌水洗涤3-5次，播种于含50mg/L卡那霉素的MS培养基中，生长条件是22℃±2℃,16h光照/8h黑暗，光照强度为100μmol·m-2·s-1。培养一周后，挑选正常萌发的阳性植株种植于土壤中，培养管理并收集T1代种子。种植T1代种子，并剪取T1代植株叶片进行转基因植株PCR检测，确认获得转基因阳性植株；将转基因阳性植株进行培养管理并收集T2代种子。
3.4 分别将转基因T2代种子（设置3个生物学重复样OE-1、OE-2、OE-3）和野生型拟南芥种子（WT）种植于土壤中，于步骤3.3相同的生长条件下培育至幼苗时期，设置两组处理：一组继续于正常条件下生长作为对照，另一组在-5℃低温处理6h，之后恢复正常培养，观察并记录各株系的形态变化，结果见图4；同时剪取处理后的叶片测定生理生化指标，通过丙二醛（MDA）含量检测试剂盒（购自北京索莱宝科技有限公司）测定MDA含量，分别使用过氧化物酶（POD）活性检测试剂盒（购自北京索莱宝科技有限公司）、超氧化物歧化酶（SOD）活性检测试剂盒（购自北京索莱宝科技有限公司）和过氧化氢酶（CAT）活性检测试剂盒（购自北京索莱宝科技有限公司）测定3种抗氧化酶活性，结果见图5。
结果发现，剑麻DREB基因过表达拟南芥植株低温处理后未产生明显冻害，在低温胁迫处理下，转基因拟南芥（OE-1、OE-2、OE-3）的MDA含量低于野生型，而3种抗氧化酶活性均高于野生型，表明剑麻DREB基因可提高植物耐寒性，可应用于抗寒性状植物的遗传育种，培育耐低温植物新品种或种苗。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
本文摘自国家发明专利，一种剑麻DREB基因及其在提高植物抗寒性中的应用，发明人：黄兴，李玉波，王博等，申请号：202610834079.0，申请日：2026.06.10
