摘 要：本发明公开了一种菌酶复配制备火麻蛋白肽及其在精酿啤酒的酿造中的应用，属于啤酒加工技术领域。本发明采用能够产多样蛋白酶的菌株：紫色红曲菌、瑞士乳杆菌进行发酵火麻蛋白后，提高火麻蛋白的生物利用度。与酶解法相比，本专利提供的菌与木瓜蛋白酶或菠萝蛋白酶联合固态发酵方法，显著提高了活性肽制备效率，同时能够显著降低水解肽的苦味，提高最终火麻活性肽的DPPH清除率。本发明的技术方案实现了在不影响火麻蛋白肽自身功能的条件下，又能增加胞外多糖的含量，得到一种富含胞外多糖的火麻蛋白肽。
权利要求书
1.一种火麻蛋白肽的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将火麻蛋白添加至无菌营养液中得到混合物；
(2)将紫色红曲菌或瑞士乳杆菌接种至步骤(1)得到的混合物中进行发酵；
(3)发酵结束后，灭菌，对灭菌后的发酵物进行热水搅拌浸提，热水浸提前对发酵物采用高压脉冲电场预处理和射流空化处理，热水浸提后，离心去除沉淀，收集上清；获得火麻蛋白肽粗提液；
(4)对火麻蛋白肽粗提液过滤除渣，采用活性炭进行脱色、脱苦，然后离心去除杂质，最后将去除杂质后的多肽液真空下浓缩后喷雾干燥，收集成品即为火麻活性肽。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述火麻蛋白的终浓度为5～7g/100mL，无菌营养液为0.3～0.4g/100mL的葡萄糖、3～4g/100mL的麸皮、无菌水；
优选地，步骤(2)为，将紫色红曲菌或瑞士乳杆菌按照体积比为10～15％(v/v)的接种量，接种至步骤(1)得到的混合物中，同时添加木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶或菠萝蜜蛋白酶进行发酵；
优选地，步骤(3)为发酵结束后，灭菌，对灭菌后的发酵物进行热水搅拌浸提，固液比为1:10～15，提取温度为50～55℃，在15～25kV/cm的电场强度下处理500～1500μs后，进行射流空化处理，处理，条件为：在温度50～55℃、常压条件下处理5～20min，射流空化处理后继续在50～55℃条件提取90～110min，离心去除沉淀，收集上清；获得火麻蛋白肽粗提液。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中的发酵条件为：当采用紫色红曲菌进行发酵时，发酵条件为：30～35℃，120～150r/min，发酵时间至少48h；当采用瑞士乳杆菌进行发酵时，发酵条件为：35～37℃，发酵时间至少48h。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶或菠萝蜜蛋白酶的添加量为：7000～10000U/g火麻蛋白。
5.根据权利要求1～4任一所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述火麻蛋白的制备方法包括：
(1)将火麻仁45～50℃烘干、粉碎、超临界脱脂后，得到火麻仁粉，取脱脂后的火麻仁粉以1：10～15的重量比加入水，用胶体磨研磨两遍进行匀浆，得到匀浆液；
(2)将得到的匀浆液高压脉冲电场预处理：向匀浆液加入食用碱，调整pH为10.0，在15～25kV/cm的电场强度下处理500～1500μs后，得到悬浮液；
(3)射流空化预处理：将经步骤(2)处理后的悬浮液体系进行射流空化处理，处理条件为：在温度50～60℃、常压条件下处理5～20min；
(4)射流空化预处理后，继续在50～60℃条件下碱提，提取时间为1.5～2小时，提取结束后，用柠檬酸调pH为4.0～4.5进行沉降，沉降后的蛋白反复水洗至中性后，进行真空冷冻干燥，得火麻蛋白。
6.一种火麻蛋白肽，其特征在于，所述火麻蛋白肽是按照权利要求1～5任一所述的方法制备得到的。
7.权利要求1～5任一所述的方法或权利要求1～5任一所述的方法制备得到的火麻蛋白肽或权利要求6所述的火麻蛋白肽在制备精酿啤酒中的应用。
8.一种火麻蛋白肽精酿啤酒的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)在糊化锅中加入质量分数为0.5～1.0％的燕麦片、20～40mLα?耐高温淀粉酶、水，1～5℃/min的升温速度阶梯式升温至98℃，得醪液；
(2)按照质量分数添加10～15份的加麦麦芽、40～45份澳麦麦芽、35～40份小麦芽麦芽，加入粉碎机内粉碎，获得粉碎混料；
向糖化锅中加水，待温度升至40～45℃时加入上述粉碎混料，同时，添加添加质量分数分别为0.08～0.1％的柠檬酸、0.007～0.01％的乳酸、0.09～0.1％的硫酸钙、0.15～0.2IU/g的木聚糖酶、1.5～2.0IU/g的β?葡聚糖复合酶；保温10～15min，再升温至50～55℃，保温15～20分钟后，将糊化锅的醪液导入糖化锅中，搅拌，升温至68～72℃，保温25～30分钟；碘试合格后升温至70～80℃后，结束糖化；将糖化完成后的糖化液过滤，收集原汁；洗糟后合并收集的麦芽汁，洗槽后，洗糟残糖1.5°P以上；合并原汁和洗槽后的麦芽汁；
(3)向步骤(2)收集得到的麦芽汁中加入硫酸钙、氯化钙，搅拌均匀，将澄清的麦芽汁升温至沸腾后，分三次加入酒花，沸腾10～15min后，添加麦芽汁质量的0.1％～0.25％的SAAZ香花，沸腾20～25min后，再次添加麦芽汁质量的0.5％～0.75％的啤酒花，煮沸20～25min，最后添加麦芽汁质量的0.1％～0.3％的SAAZ香花，继续煮沸5～10min，然后冷却，降温；
(4)沉淀、过滤后，向麦芽汁中充氧，充氧量9?10mg/L，满罐酿酒酵母添加量1000?1100万/mL；
(5)主发酵：将加入酿酒酵母的麦芽汁输送至发酵罐中，封罐发酵(控温18～20℃)，当双乙酰0.09mg/L，发酵度63?65％时，主发酵结束；
(6)主发酵结束后，向发酵罐中添加权利要求1～5任一所述的方法制备得到的火麻蛋白肽或权利要求6所述的火麻蛋白肽，添加量为1～2％；添加后进行降温、冷储，冷储45?60天后，采用离心机进行离心，滤酒后的酒中酵母数800?1000万/mL；冷储45?60天后，采用离心机进行离心后，包装成品。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述啤酒花为SAAZ啤酒花；所述α?耐高温淀粉酶的酶活为2万U/ml。10.权利要求8～9所述的制备方法制备得到的火麻蛋白肽精酿啤酒。
技术领域
本发明涉及一种菌酶复配制备火麻蛋白肽及其在精酿啤酒的酿造中的应用，属于啤酒加工技术领域。
背景技术
红曲多糖作为真菌多糖的一类，最早于1988年被田军从紫红曲霉(Monascus purpureus)935菌株发酵液中分离发现，通过凝胶柱层析进行分离纯化得到胞外多糖，分部收集后，洗脱曲线为单一对称洗脱峰，采用苯酚?硫酸法测定，显色，结合纸层析表明组分均一且纯度较好，且基本确定了红曲多糖的分子量，约为40万；通过硅胶薄层层析测定单糖组成由甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成，其摩尔比为1:2:4，从单糖组成，可定义其为杂聚糖；通过气相色谱、红外光谱，核磁共振氢谱等色谱与光谱技术，该多糖分子中是以β(1→3)位糖苷键为主，同时含有1→6和1→2位糖苷键，根据有无支链，可将多糖分为直链多糖与支链多糖，而多糖支链的丰度在多糖免疫学性质的研究中较为重要，通常支链丰度较高的β(1→3)葡聚糖生物活性较强，β(1→3)葡聚糖由β型葡萄糖聚合形成，较易卷曲形成螺旋结构，其功能性较为显著。
张建峰通过DTH试验和碳粒廓清试验发现红曲多糖(来自红曲AS 3.4701)能提高小鼠细胞免疫功能和腹腔巨噬细胞吞噬能力，促使小鼠外周血E?玫瑰环形成，增加体内淋巴细胞转化率，使非特异性免疫加强。淋巴细胞脏体指数以及脾脏抗体生成细胞检测结果表明，红曲多糖对小鼠的细胞免疫和体液免疫有一定的增强作用。Tseng等发现红曲山药多糖(RMRP)和红曲米多糖(RMDP)对Raw264.7细胞的免疫调节和抗氧化作用，山药多糖和红曲米多糖还具有抗氧化和免疫调节的潜力，可以开发为新的膳食补充剂，红曲NTU 568发酵的大米和山药在体内外都具有保健功能。综上所述，红曲作为中国传统的药食两用真菌，富含生物活性化合物，如红曲多糖等。
目前，国内对火麻仁的研究和利用主要集中在火麻仁油的提取和利用上，通常都是将火麻仁榨油，渣滓用作动物饲料，造成大量的资源浪费。火麻仁中蛋白质的含量较高，还含有多种氨基酸，对火麻仁进行深加工，充分利用其营养成分，有利于火麻产业的发展。饮料作为一种人们喜爱的饮品，通常糖分高，蛋白含量低，添加剂多，多饮不利于身体健康，而开发出一种具有保健价值的火麻啤酒，有利于人体健康，还能有效促进火麻业的健康发展，提高农业经济效益。
啤酒是以麦芽为主要原料，并添加啤酒花，经过液态糊化和糖化，再经过液态发酵酿制而成。它富含多种氨基酸、维生素、低分子糖、无机盐和多种酶，是一种低浓度酒精饮料。但人们生活水平的不断提高，传统啤酒已经难以满足他们的需求，开发不同风味和功能性营养需求的啤酒是目前啤酒酿造领域的一个重要研究方向。
发明人前期研发了一种火麻蛋白肽精酿啤酒，主要是通过中性蛋白酶和复合蛋白酶对火麻蛋白进行酶解提取，发现酶解提取后，酿造得到的精酿啤酒中的蛋白质只有68％；还是存在火麻蛋白肽中小分子蛋白肽数量不多的问题，同时采用之前的方法得到的火麻蛋白肽中的蛋白质的含量不够，导致酿造后得到的精酿啤酒的蛋白的含量也比较低，因此，本发明需要解决如何得到一种高小分子蛋白肽含量的火麻蛋白肽。
并且现有的研究都只是几种在火麻蛋白肽精酿啤酒上，而一种富含胞外多糖的火麻蛋白肽极少有人研究，并且，如何设计工艺，既能实现在不影响火麻蛋白肽自身功能，又能增加胞外多糖的含量的情况下，得到一种富含胞外多糖的火麻蛋白肽，并且采用火麻蛋白肽制备精酿啤酒，是亟待解决的问题。
发明内容
本发明提供了一种火麻蛋白肽的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将火麻蛋白添加至无菌营养液中，所述火麻蛋白的终浓度为5～7g/100mL，无菌营养液为0.3～0.4g/100mL的葡萄糖、3～4g/100mL的麸皮、无菌水；
(2)将紫色红曲菌或瑞士乳杆菌按照体积比为10～15％(v/v)的接种量，接种至步骤(1)得到的混合物中进行发酵；
(3)发酵结束后，灭菌，对灭菌后的发酵物进行热水搅拌浸提，固液比为1:10～15，提取温度为50～55℃，在15～25kV/cm的电场强度下处理500～1500μs后，进行射流空化处理，处理，条件为：在温度50～55℃、常压条件下处理5～20min，射流空化处理后继续在50～55℃条件提取90～110min，离心去除沉淀，收集上清；获得火麻蛋白肽粗提液；
(4)对火麻蛋白肽粗提液过滤除渣，采用活性炭进行脱色、脱苦，然后离心去除杂质，最后将去除杂质后的多肽液真空下浓缩后喷雾干燥，收集成品即为火麻活性肽。
在一种实施方式中，所述紫色红曲菌添加的是紫色红曲菌悬液，菌浓为：1～5×109个/mL在一种实施方式中，所述紫色红曲菌悬液的制备方法为：
将紫色红曲菌划线于麦芽汁琼脂培养基上，30～35℃培养5～7d，培养至红曲菌长出孢子。往上述麦芽汁琼脂培养基中注入无菌水，并利用无菌接种环刮取培养基表面菌丝，转移至装有无菌水的三角瓶中，150～200r/min，震荡2～30min，打散孢子，再用4层纱布将其过滤到新的50mL的三角瓶中，制得孢子悬浮液。用无菌水稀释并调整孢子浓度为1×109个/mL，得到孢子悬液。
在一种实施方式中，所述瑞士乳杆菌添加的是瑞士乳杆菌悬液，菌浓为1～5×109CFU/mL在一种实施方式中，所述瑞士乳杆菌悬液的制备方法为：
将?80℃下保存的菌株接种到MRS培养基中，35～37℃厌氧下活化培养16～18h，活化三代后，取瑞士乳杆菌在MRS液体培养基中，于35～37℃厌氧下培养24～36h，于4℃、6000×g离心3min收集菌体，弃去上清并无菌水重悬菌体，使菌浓度达到1×109CFU/mL，制备得到菌悬液。
在一种实施方式中，步骤(2)为，将紫色红曲菌或瑞士乳杆菌按照体积比为10～15％(v/v)的接种量，接种至步骤酶或菠萝蜜蛋白酶进行发酵。
在一种实施方式中，步骤(2)中的发酵条件为：当采用紫色红曲菌进行发酵时，发酵条件为：30～35℃，120～150r/min，发酵时间至少48h；
当采用瑞士乳杆菌进行发酵时，发酵条件为：35～37℃，发酵时间至少48h。
在一种实施方式中，所述木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶或菠萝蜜蛋白酶的添加量为：7000～10000U/g火麻蛋白。
在一种实施方式中，步骤(1)中，所述火麻蛋白的制备方法包括：
(1)将火麻仁45～50℃烘干、粉碎、超临界脱脂后，得到火麻仁粉，取脱脂后的火麻仁粉以1：10～15的重量比加入水，用胶体磨研磨两遍进行匀浆，得到匀浆液；
(2)将得到的匀浆液高压脉冲电场预处理：向匀浆液加入食用碱，调整pH为10.0，在15～25kV/cm的电场强度下处理500～1500μs后，得到悬浮液；
(3)射流空化预处理：将经步骤(2)处理后的悬浮液体系进行射流空化处理，处理条件为：在温度50～60℃、常压条件下处理5～20min；
(4)射流空化预处理后，继续在50～60℃条件下碱提，提取时间为1.5～2小时，提取结束后，用柠檬酸调pH为4.0～4.5进行沉降，沉降后的蛋白反复水洗至中性后，进行真空冷冻干燥，得火麻蛋白。
本发明还提供了一种火麻蛋白肽，所述火麻蛋白肽是按照下述方法制备得到的：
(1)将火麻蛋白添加至无菌营养液中，所述火麻蛋白的终浓度为5～7g/100mL，无菌营养液为0.3～0.4g/100mL的葡萄糖、3～4g/100mL的麸皮、无菌水；
(2)将紫色红曲菌或瑞士乳杆菌按照体积比为10～15％(v/v)的接种量，接种至步骤(1)得到的混合物中进行发酵；
(3)发酵结束后，灭菌，对灭菌后的发酵物进行热水搅拌浸提，固液比为1:10～15，提取温度为50～55℃，在15～25kV/cm的电场强度下处理500～1500μs后，进行射流空化处理，处理，条件为：在温度50～55℃、常压条件下处理5～20min，射流空化处理后继续在50～55℃条件提取90～110min，离心去除沉淀，收集上清；获得火麻蛋白肽粗提液；
(4)对火麻蛋白肽粗提液过滤除渣，采用活性炭进行脱色、脱苦，然后离心去除杂质，最后将去除杂质后的多肽液真空下浓缩后喷雾干燥，收集成品即为火麻活性肽。
在一种实施方式中，步骤(2)为，将紫色红曲菌或瑞士乳杆菌按照体积比为10～15％(v/v)的接种量，接种至步骤(1)得到的混合物中，同时添加木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶或菠萝蜜蛋白酶进行发酵。
在一种实施方式中，步骤(2)中的发酵条件为：当采用紫色红曲菌进行发酵时，发酵条件为：30～35℃，120～150r/min，发酵时间至少48h；
当采用瑞士乳杆菌进行发酵时，发酵条件为：35～37℃，发酵时间至少48h。
在一种实施方式中，所述木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶或菠萝蜜蛋白酶的添加量为：7000～10000U/g火麻蛋白。
在一种实施方式中，步骤(1)中，所述火麻蛋白的制备方法包括：
(1)将火麻仁45～50℃烘干、粉碎、超临界脱脂后，得到火麻仁粉，取脱脂后的火麻仁粉以1：10～15的重量比加入水，用胶体磨研磨两遍进行匀浆，得到匀浆液；
(2)将得到的匀浆液高压脉冲电场预处理：向匀浆液加入食用碱，调整pH为10.0，在15～25kV/cm的电场强度下处理500～1500μs后，得到悬浮液；
(3)射流空化预处理：将经步骤(2)处理后的悬浮液体系进行射流空化处理，处理条件为：在温度50～60℃、常压条件下处理5～20min；
(4)射流空化预处理后，继续在50～60℃条件下碱提，提取时间为1.5～2小时，提取结束后，用柠檬酸调pH为4.0～4.5进行沉降，沉降后的蛋白反复水洗至中性后，进行真空冷冻干燥，得火麻蛋白
本发明还提供了上述方法或上述方法制备得到的火麻蛋白肽或上述火麻蛋白肽在制备精酿啤酒中的应用。
本发明还提供了一种火麻蛋白肽精酿啤酒的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)在糊化锅中加入质量分数为0.5～1.0％的燕麦片、20～40mLα?耐高温淀粉酶、水，1～5℃/min的升温速度阶梯式升温至98℃，得醪液；
(2)按照质量分数添加10～15份的加麦麦芽、40～45份澳麦麦芽、35～40份小麦芽麦芽，加入粉碎机内粉碎，获得粉碎混料；
向糖化锅中加水，待温度升至40～45℃时加入上述粉碎混料，同时，添加添加质量分数分别为0.08～0.1％的柠檬酸、0.007～0.01％的乳酸、0.09～0.1％的硫酸钙、0.15～0.2IU/g的木聚糖酶、1.5～2.0IU/g的β?葡聚糖复合酶；保温10～15min，再升温至50～55℃，保温15～20分钟后，将糊化锅的醪液导入糖化锅中，搅拌，升温至68～72℃，保温25～30分钟；碘试合格后升温至70～80℃后，结束糖化；将糖化完成后的糖化液过滤，收集原汁；洗糟后合并收集的麦芽汁，洗槽后，洗糟残糖1.5°P以上；合并原汁和洗槽后的麦芽汁；
(3)向步骤(2)收集得到的麦芽汁中加入硫酸钙、氯化钙，搅拌均匀，将澄清的麦芽汁升温至沸腾后，分三次加入酒花，沸腾10～15min后，添加麦芽汁质量的0.1％～0.25％的SAAZ香花，沸腾20～25min后，再次添加麦芽汁质量的0.5％～0.75％的啤酒花，煮沸20～25min，最后添加麦芽汁质量的0.1％～0.3％的SAAZ香花，继续煮沸5～10min，然后冷却，降温；
(4)沉淀、过滤后，向麦芽汁中充氧，充氧量9?10mg/L，满罐酿酒酵母添加量1000?1100万/mL；
(5)主发酵：将加入酿酒酵母的麦芽汁输送至发酵罐中，封罐发酵(控温18～20℃)，当双乙酰0.09mg/L，发酵度63?65％时，主发酵结束；
(6)主发酵结束后，向发酵罐中添加权利要求1～5任一所述的方法制备得到的火麻蛋白肽或权利要求6所述的火麻蛋白肽，添加量为1～2％；添加后进行降温、冷储，冷储45?60天后，采用离心机进行离心，滤酒后的酒中酵母数800?1000万/mL；
冷储45?60天后，采用离心机进行离心后，包装成品。
在一种实施方式中，所述啤酒花为SAAZ啤酒花；所述α?耐高温淀粉酶的酶活为2万U/ml。
本发明还提供了上述制备方法制备得到的火麻蛋白肽精酿啤酒。
有益效果
(1)本发明采用高压脉冲电场结合射流空化处理后，极大的提高了蛋白的溶解度和菌株发酵性能，并且，紫色红曲菌和瑞士乳杆菌发酵后的火麻活性肽的DPPH清除率分别提高至85.2％和84.3％；
(2)本发明采用能够产多样蛋白酶的菌株：枯草芽胞杆菌、米曲霉、解淀粉芽胞杆菌解淀粉亚种、紫色红曲菌、瑞士乳杆菌进行发酵火麻蛋白后，提高火麻蛋白的生物利用度。与酶解法相比，本专利提供的菌与木瓜蛋白酶或菠萝蛋白酶联合固态发酵方法，显著提高了活性肽制备效率，同时能够显著降低水解肽的苦味，提高最终火麻活性肽的DPPH清除率。
(3)本发明的技术方案实现了在不影响火麻蛋白肽自身功能的条件下，又能增加胞外多糖的含量，得到一种富含胞外多糖的火麻蛋白肽。
具体实施方式
下述实施例中所涉及的所述中性蛋白酶购自阿拉丁；所述木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、购自翔洋生物；所述菠萝蛋白酶购自阿拉丁。
下述实施例中所涉及的枯草芽胞杆菌、米曲霉、解淀粉芽胞杆菌解淀粉亚种、紫色红曲菌、瑞士乳杆菌均购自CICC，编号分别为CICC 23093、CICC 2339、CICC 20124、CICC41605和CICC 41606、CICC 20997。
下述实施例中所涉及的微生物菌剂的制备：
枯草芽孢杆菌菌液：
取枯草芽孢杆菌接种于营养肉汤培养基中，37℃下活化2至3代，取枯草芽孢杆菌在营养肉汤培养基中，于28℃培养24h，于4℃、6000×g离心15min收集菌体，弃去上清并无菌水重悬菌体，使菌浓度达到1×109CFU/mL，制备得到菌悬液。
米曲霉悬液：
将米曲霉划线于麦芽汁琼脂培养基上，28℃培养7d，培养至米曲霉长出孢子。往上述麦芽汁琼脂培养基中注入无菌水，并利用无菌接种环刮取培养基表面菌丝，转移至装有无菌水的三角瓶中，200r/min，震荡30min，打散孢子，再用4层纱布将其过滤到新的50mL的三角瓶中，制得孢子悬浮液。用无菌水稀释并调整孢子浓度为109个/mL，得到孢子悬液。
解淀粉芽胞杆菌解淀粉亚种菌悬液：
取解淀粉芽胞杆菌解淀粉亚种接种于营养肉汤培养基中，28℃下活化2至3代，取解淀粉芽胞杆菌解淀粉亚种在营养肉汤培养基中，于28℃培养24h，于4℃、6000×g离心15min收集菌体，弃去上清并无菌水重悬菌体，使菌浓度达到1×109CFU/mL，制备得到菌悬液。
紫色红曲菌悬液：
将紫色红曲菌划线于麦芽汁琼脂培养基上，35℃培养7d，培养至红曲菌长出孢子。往上述麦芽汁琼脂培养基中注入无菌水，并利用无菌接种环刮取培养基表面菌丝，转移至装有无菌水的三角瓶中，200r/min，震荡30min，打散孢子，再用4层纱布将其过滤到新的50mL的三角瓶中，制得孢子悬浮液。用无菌水稀释并调整孢子浓度为109个/mL，得到孢子悬液。
瑞士乳杆菌菌悬液
将?80℃下保存的菌株接种到MRS培养基中，37℃厌氧下活化培养16h，活化三代后，取瑞士乳杆菌在MRS液体培养基中，于37℃厌氧下培养24h，于4℃、6000×g离心3min收集菌体，弃去上清并无菌水重悬菌体，使菌浓度达到1×109CFU/mL，制备得到菌悬液。
下述实施例中所涉及的培养基如下：
MRS液体培养基(1L)：酪蛋白胨(胰酶消化)10.0g，牛肉浸粉10.0g，酵母浸粉5.0g，葡萄糖20.0g，吐温80 1.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸三铵2.0g，K2HPO4 2.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·H2O 0.2g，pH 6.2～6.5，以上成分在121℃，灭菌15min。
MRS固体培养基：在MRS液体培养基的基础上添加15g的琼脂。
麦芽汁液体培养基：5°Bé麦芽汁1L。
麦芽若干，粉碎后，加入4倍于麦芽重量的水，搅拌均匀，在55℃～60℃保温箱中糖化4h，取出过滤，得麦芽汁，测量此麦芽汁的体积(1L)和浓度(5°Bé麦芽汁)后，分装于已灭菌的三角瓶中。121℃，灭菌15min后备用。以上成分121℃，灭菌15min。
麦芽汁固体培养基：在麦芽汁液体培养基的基础上添加15g的琼脂。
营养肉汤培养基(1L)：蛋白胨5.0g，牛肉浸粉3.0g，NaCl 5.0g，5mg MnSO4·H2O，pH 7.0；以上成分121℃，灭菌15min。
营养肉汤固体培养基：在营养肉汤培养基的基础上添加15g的琼脂。
下述实施例中所涉及的检测方法：
DPPH检测方法
测定方法：被测物质的抗氧化性研究是测定其对DPPH清除能力作为评估，采用Pérez?Jiménez等的方法的基础上进行适当的修改。0.3m L的发酵液添加到2.7m L 0.0001mol/L DPPH新鲜配制的甲醇溶液中，用力摇匀10s，在黑暗中放置30min后，用紫外可见分光光度计在517nm测定的吸光度，用没有加样品的DPPH甲醇溶液作为空白对照，抑制率可用以下公式表示：
Abst＝0代表空白的吸光度，Abst＝30min代表加入水解液后保温30min的吸光
火麻活性肽蛋白质、啤酒的蛋白质含量
采用凯氏定氮法GB5009 2010测定。
肽含量的检测：
依据GB/T22729?2008中关于低聚肽的检测方法进行检测。
紫色红曲菌胞外粗多糖产量测定
将火麻蛋白肽粗提液定容至100mL，取15mL加入60m L无水乙醇中,在5℃下静置8h，过滤，在80℃烘干12h至恒重，称量，称量换算即为胞外粗多糖产量。
实施例1：火麻蛋白肽的制备方法
1、火麻蛋白的制备
(1)将火麻仁45～50℃低温烘干、粉碎(过60目筛)、超临界脱脂后，得到火麻仁粉，取脱脂后的火麻仁粉以1：10的重量比加入纯净水，用胶体磨研磨两遍进行匀浆，胶体磨间隙为0.15mm，匀浆时间为10min，将两次匀浆后的物料过500目筛，得到匀浆液；
(2)将得到的匀浆液高压脉冲电场预处理：向匀浆液加入食用碱，调整pH为10.0，在18kV/cm的电场强度下处理1000μs后，得到悬浮液；
(3)射流空化预处理：将经步骤(2)处理后的悬浮液体系进行射流空化处理，处理条件为：温度50～60℃、20min、常压；
(4)射流空化预处理后，继续在60℃条件下碱提，提取时间为1.5小时，提取结束后，用柠檬酸调pH为4.5进行沉降，沉降后的蛋白反复水洗至中性后，进行真空冷冻干燥，得火麻蛋白；
2、火麻蛋白肽的制备
(1)加入无菌营养液至火麻蛋白中，火麻蛋白的终浓度为5g/100mL，无菌营养液中含有0.3g/100mL的葡萄糖、3g/100mL的麸皮。
(2)分别将枯草芽孢杆菌菌液、米曲霉悬液、解淀粉芽胞杆菌解淀粉亚种菌悬液、紫色红曲菌悬液、瑞士乳杆菌菌悬液按照与步骤(1)得到的混合物的总的体积比为15％(v/v)的接种量，接种至步骤(1)得到的混合物中进行发酵，发酵条件如表1所示。
表1 不同菌株的发酵条件
(3)发酵结束后在100℃灭菌5min；将去离子水加入灭菌后的发酵物进行热水搅拌浸提，固液比为1:10(w/v)，提取温度为55℃，在18kV/cm的电场强度下处理1000μs(促进蛋白溶解)后，进行射流空化处理(进一步促进蛋白溶解)，处理条件为：温度55℃、20min、常压；继续提取，提取时间为100min，离心去除沉淀，按照上述方法提取2次，合并上清提取液，收集上清；获得火麻蛋白肽粗提液；
(4)采用200～300目振动筛对火麻蛋白肽粗提液过滤除渣，采用活性炭对过滤后的火麻蛋白肽粗提液进行脱色、脱苦，然后12000g高速离心去除杂质，最后将精制的多肽液在70℃/650kPa真空下浓缩至45％，在出风温度130℃下喷雾干燥，收集成品即为火麻活性肽；结果如表2所示：
表2 不同菌株发酵后的结果
(5)分别检测步骤(3)中采用紫色红曲菌制备得到的火麻蛋白肽粗提液中胞外粗多糖的含量
表3 不同紫色红曲发酵后的结果
结果显示：采用本发明的方法，制备得到的火麻蛋白肽粗提液中富含粗多糖，赋予了火麻蛋白肽更多的性能。
综上，本发明采用高压脉冲电场结合射流空化处理后，极大的提高了蛋白的溶解度和菌株发酵性能，并且，紫色红曲菌和瑞士乳杆菌发酵后的性能比较优越；后续以这两个菌株继续研究。
实施例2：菌酶复配制备火麻蛋白肽
具体步骤如下：
1、按照实施例1的步骤1的方法制备得到火麻蛋白；
2、菌酶复配制备火麻蛋白肽
(1)加入无菌营养液至火麻蛋白中，火麻蛋白的终浓度为5g/100mL，无菌营养液中含有0.3g/100mL的葡萄糖、3g/100mL的麸皮。
(2)分别将紫色红曲菌悬液、瑞士乳杆菌菌悬液按照与步骤(1)得到的混合物的总的体积比为15％(v/v)的接种量，接种至步骤(1)得到的混合物；同时，添加8000U/g火麻蛋白木瓜蛋白酶、8000U/g火麻蛋白无花果蛋白酶或8000U/g火麻蛋白菠萝蛋白酶，进行共同发酵，发酵条件如表4所示：
表4 菌酶复配的条件
(3)发酵结束后在100℃灭菌5min；将去离子水加入灭菌后的发酵物进行热水搅拌浸提，固液比为1:10(w/v)，提取温度为55℃，在18kV/cm的电场强度下处理1000μs(促进蛋白溶解)后，进行射流空化处理(进一步促进蛋白溶解)，处理条件为：温度55℃、20min、常压；继续提取，提取时间为100min，离心去除沉淀，按照上述方法提取2次，合并上清提取液，收集上清；获得火麻蛋白肽粗提液；
(4)采用200～300目振动筛对火麻蛋白肽粗提液过滤除渣，采用活性炭对过滤后的火麻蛋白肽粗提液进行脱色、脱苦，然后12000g高速离心去除杂质，最后将精制的多肽液在70℃/650kPa真空下浓缩至45％，在出风温度130℃下喷雾干燥，收集成品即为火麻活性肽；结果如表5～6所示；
表5 瑞士乳杆菌发酵后的结果
表6 不同紫色红曲菌发酵后的结果
结果显示：
(1)由于紫色红曲菌的最适温度为35℃，瑞士乳杆菌的最适温度为37℃，而木瓜蛋白酶的最适温度为50～55℃(最适pH6.0～7.0)，无花果蛋白酶的最适温度为65℃(最适pH5.7)，菠萝蛋白酶的最适温度为40～55℃(最适pH6.0～8.0)；
(2)在温度适配上看，菠萝蛋白酶更能在我们发酵条件下发挥作用，并且，由于紫色红曲菌发酵后期pH值会增加，而菠萝蛋白酶最适pH6.0～8.0，因此，紫色红曲菌与菠萝蛋白酶的组合是制备高抗氧化肽的火麻蛋白肽的最佳组合。
(3)从表格中可知，采用紫色红曲菌CICC 41605与酶进行复配后，与紫色红曲菌CICC 41606相比，酶对于菌株有一定的抑制作用，虽然抗氧化性影响不是很大，但是影响了菌株的胞外多糖的能力。
实施例3：火麻蛋白肽精酿啤酒的酿造
具体步骤如下：
(1)糊化：在糊化锅中加入质量分数为0.5％的燕麦片、20mLα?耐高温淀粉酶(2万U/ml)、水，阶梯式升温(1℃/min)至98℃，得醪液。
(2)称取重量百分比下述原料：15％加麦麦芽、45％澳麦麦芽、40％小麦芽麦芽，加入粉碎机内粉碎，获得粉碎混料；
向糖化锅中加水，待温度升至40℃时加入上述粉碎混料(添加质量分数分别为0.08％的柠檬酸、0.007％的乳酸、0.09％的硫酸钙，5min后，继续添加0.15IU/g的木聚糖酶、1.5IU/g的β?葡聚糖复合酶)，保温10分钟，再升温至50℃，保温20分钟，此时，将糊化锅的醪液导入糖化锅中，搅拌，升温至68℃，保温30分钟；碘试合格后升温至76℃，结束糖化；
将糖化完成后的糖化液泵送到过滤机，过滤，得到澄清透亮的麦芽汁；过滤完成后静置3分钟后，循环澄清5?10分钟，至浊度≤30EBC(无较大颗粒)，收集原汁；
洗糟：分三次洗糟，洗糟水温度72?76℃，PH＝5.4?5.6，三次洗槽后合并收集的麦芽汁，洗糟残糖1.5°P以上；合并原汁和洗槽后的麦芽汁；
(3)向步骤(2)收集得到的麦芽汁中加入硫酸钙(每100升麦芽汁中添加38～114mg的硫酸钙)，氯化钙(每100升麦芽汁中添加50?150mg的氯化钙)，搅拌均匀，将澄清的麦芽汁升温至沸腾后，分三次加入酒花，沸腾10min后，添加麦芽汁质量的0.15％的SAAZ香花，沸腾20min后，再次添加麦芽汁质量的0.5％的SAAZ香花，继续煮沸20min，最后添加麦芽汁质量的0.2％的SAAZ香花，继续煮沸10min，然后冷却，降温。
(4)沉淀：冷却至18℃回旋沉淀15分钟，过滤。
(5)向步骤(4)得到的过滤后的麦芽汁充氧，充氧量9?10mg/L，满罐酿酒酵母添加量1000?1100万/mL；
(6)主发酵：将加入酿酒酵母的麦芽汁输送至发酵罐中，封罐发酵(控温18～20℃)，当双乙酰0.09mg/L，发酵度63?65％时，主发酵结束，向发酵罐中添加实施例2制备得到的火麻蛋白肽，按照质量分数，添加量为1％。添加后进行降温冷储。
冷储温度?1.0±0.3℃，直至滤酒，满罐后无压力控制，自然升压至0.08?0.09Mpa，恒压至滤酒；
(7)滤酒
冷储45?60天后，采用离心机进行离心，滤酒后的清酒中酵母数800?1000万/mL，清酒温度?1.0～?0.5℃。
(8)包装成品。
实施例4：火麻蛋白肽精酿啤酒的酿造
具体酿造方法同实施例3，区别在于，步骤(6)中，在主发酵结束后，向发酵罐中添加实施例1制备得到的紫色红曲菌或瑞士乳杆菌制备得到的火麻蛋白肽。
实施例5：实验结果
分别检测实施例3和实施例4制备得到的啤酒中蛋白质的含量，结果如表7所示。
表7 添加不同的火麻蛋白肽得到的的啤酒中的蛋白质的含量
检测结果表明，与普通的啤酒相比，该发明的啤酒具有明显较高的蛋白质含量，多肽的含量也较高。具有利润空间大、经济效益好的特点，有益于广泛推广。
本发明通过在制备工艺中添加火麻蛋白肽的设置可保持传统啤酒的口感、风味、泡沫、色度等外，丰富啤酒酵母的营养，提高啤酒的蛋白质、多肽的含量，调整了啤酒的各种氨基酸的比例，赋予了啤酒润燥通便、补虚、提高人体免疫力和改善人体肠道功能、延缓衰老等保健功能使最终的成品更适合人体的营养和保健需求。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
文章摘自国家发明专利，一种菌酶复配制备火麻蛋白肽及其在精酿啤酒的酿造中的应用，发明人：刁佳新，郭守林，任显静，申请号：202510515774 .6，申请日：2025.04.23
