摘 要：本研究在生理成熟期取亚麻根际土壤，利用16S rＲNA基因高通量测序技术和生物信息学的方法，分析不同浓度柠檬酸处理对亚麻根际土壤细菌的多样性、丰富度和群落结构等的影响。试验结果表明，高浓度柠檬酸处理后的亚麻根际土壤细菌的ACE、Chao1、Simpson和Shannon指数值均为最高，其中ACE和Chao1指数值显著大于对照;PCoA分析结果表明，高浓度柠檬酸处理后的亚麻根际土壤细菌OTU组成与对照土壤细菌OTU组成之间的群落结构差异最大;从细菌组成来看，所有处理的优势菌门均为髌骨细菌门，平均占比为49.50%，优势菌属均为TM7a，平均占比为32.99%。本试验有助于为后续研究外源有机酸对亚麻镉吸收的影响提供一定的理论依据。
关键词：柠檬酸; 亚麻; 根际土壤; 细菌
亚麻(Linum usitatissimum L．)是亚麻科(Linaceae)亚麻属(Linum)一年生草本植物，在中国有着数千年的栽培历史，从东北、西北、华北地区到西南地区的云南大理、西双版纳等地均有种植。亚麻是世界上最古老的纤维作物之一，亚麻纤维呈天然的纺锤形结构，是一种束纤维，具有独特的果胶质斜边孔以及中空的纤维构造，几乎可以与所有的化学及天然纤维混用，在吸汗、排湿、透气、抗菌等方面具有很大优势，常被用作生产高档服装及生活用品等［1］。亚麻还是重要的油料作物，亚麻籽油也称亚麻油，是高档食用油，具有很高的营养价值和经济价值。现代科学研究发现，亚麻籽油中富含有人体必需的不饱和脂肪酸—α-亚麻酸，α-亚麻酸具有益智健脑、改善视力，以及降低血脂、降低血糖、降低血黏度、预防心脑血管疾病等多种保健功效，因此，α-亚麻酸被认为是亚麻油的功效成分。此外，亚麻适应性很强，生物量大，对镉(Cd)等重金属都有很强的耐受性，是一种比较理想的Cd污染农田替代种植作物［2］。
有机酸广泛存在于植物体内和根际环境中，能为植物根际微生物的生长及繁殖等过程提供碳、氮等营养元素，而根际微生物与土壤健康情况密切相关，对植物的生长、发育、产量等都有重要影响，可以通过调控土壤酶活性影响植物根系对土壤养分的吸收［3］。因此，有机酸在土壤中具有重要的生态功能。研究表明，低分子量的有机酸能够与土壤中的金属离子形成复合物，从而改变土壤中重金属的生物有效性［4］。柠檬酸(citric acid，CA)是从植物根系分泌物中提取的化合物，毒性低、降解性高，能够在一定程度上增加植物对Cd的耐性。詹淑威等［5］发现，外施柠檬酸可以显著增加小飞扬草中的Cd含量;薛博晗等［6］的研究结果表明，一定浓度的柠檬酸能够显著增加披碱草根部对Cd的吸收。
微生物多样性测序是一种利用高通量测序技术对PCＲ所扩增的16S、18S、ITS等微生物物种特征序列进行检测的方法。此类方法不需要对微生物进行分离纯化培养，尤其适用于环境微生物等样本的研究。其中，16S rＲNA基因为原核生物的核糖体特征编码序列，常用于细菌等物种分类以及进化关系研究。对亚麻根际Cd污染土壤进行扩增子测序，可获得更加全面的根际土壤微生物物种和丰度等信息。目前，关于外源有机酸对植物Cd吸收积累的差异研究比较多［5-8］，对根际Cd污染土壤微生物的研究还鲜有报道。
本研究采用16S rＲNA基因高通量测序技术和生物信息学的方法，分析不同浓度柠檬酸处理对亚麻根际土壤细菌的多样性、丰度和群落结构等的影响。本研究有助于为后期解析外源有机酸对亚麻Cd吸收的影响奠定理论基础。
1 材料和方法
1.1 供试材料
本试验所用亚麻品种为陇亚15，种植于浙江省园林植物与花卉研究所的试验大棚内。
1.2试验设计
盆栽试验时，以溶液的形式将CdCl2·2.5H2O一次性均匀地加入供试土壤中，使土壤Cd含量(以纯Cd计算)为1.0 mg·kg－1。每盆装风干土40 kg，加入适量有机肥作为基肥。每个处理播种3盆。亚麻到达快速生长期时，将0、0.5、1.5、2.5 mmol·kg－1的柠檬酸加入到土壤中，分别记作CK、CA1、CA2、CA3，每隔14 d添加1次，共添加3次。
1.3样品采集
亚麻达到生理成熟期时，采用五点取样法，挖取亚麻植株，摇晃并留下约1 mm的根表泥土，将根系放进50mL离心管中，加入30mL PBS，180r·min－1振荡20 min，洗脱根表泥土，将根取出，其余的溶液4000r·min－1离心20min，去除上清液，收集沉淀置于－80℃保存备用。
1.4土壤DNA提取、PCＲ扩增和测序土壤DNA提取
使用HiPure Soil DNA提取试剂盒(Magen，Guangzhou，Chi)，具体步骤按照操作指南进行。
使用引物341F(5’-CCTACGGGNGGCWGCAGG-3’)和806Ｒ(5’-GGACTACHVGGGTATCTA AT-3’)［9］对16S rＲNA基因的V3～V4区进行PCＲ扩增。扩增体系为50μL，包含10μL 5×Q5@反应缓冲液(New England Biolabs，美国)，10μL 5×Q5@高GC增强剂(New England Biolabs，美国)，1.5μL 2.5 mmol·L－1 dNTPs(New England Biolabs，美国)，1.5μL上下游引物(10μmol·L－1)，0.2μL Q5@高保真DNA聚合酶(New England Biolabs，美国)，50 ng模板DNA。扩增程序为:95℃预变性5 min;95℃1min，60℃1 min，72℃1 min，共进行30个循环;最后72℃延伸7 min。使用2%琼脂糖凝胶评估扩增产物质量，利用AMPure XP Beads(Beckman，CA，USA)进行PCＲ产物纯化，使用Qubit 3.0进行定量。使用Illumina DNA Prep Kit(Illumina，CA，USA)构建测序文库。使用ABI StepOnePlusＲeal-Time PCＲSystem(Life Technologies，Foster City，USA)进行文库质量检测。合格的文库采用Novaseq 6000的PE250模式pooling上机测序。
1.5数据分析与处理
利用SPSS 25.0软件对数据进行单因素方差分析(ANOVA)，利用最小显著差法(LSD)进行显著性差异分析。
2 结果与分析
2.1 测序结果分析
对所有样品的细菌16SrＲNA基因的V3～V4区进行测序，共得到1258751条有效序列，最长序列长度为474bp，最短序列长度为201bp，平均序列长度为452bp;获得亚麻根际土壤细菌OTU共23548个，其中CK中的OTU数量为5756个，CA1、CA2和CA3中的OTU数量分别为5915、5334、6543个。稀释曲线可以用来评价测序量是否足以覆盖所有类群，并间接反映样品中物种的丰富程度。如图1所示，所有样品的细菌稀释曲线的趋势逐渐平缓，说明测序深度已经基本覆盖到样品中所有的物种，可以用来研究细菌菌群的群落结构。
图1 根际土壤样品细菌稀释曲线
2.2 α多样性分析
α多样性是指特定生境或者生态系统内的物种丰富程度、多样性情况，可以指示生境物种隔离的程度，通常利用物种丰富度以及物种均匀度两个重要指标来计算。ACE指数和Chao1指数主要体现样本的物种丰富度信息，Shannon指数和Simpson指数则可以综合体现物种的丰富度和均匀度，数值越大，多样性越高［10］。
细菌多样性的分析结果表明(表1)，CK、CA1、CA2和CA3的根际土壤测序覆盖度均在99%以上，表明测序数据充足，结果都可以反映各个处理的真实情况。从ACE指数来看，CA3的ACE指数值最大，与对照相比具有显著性差异，说明在2.5mmol·kg－1的柠檬酸处理下，亚麻根际土壤的细菌丰富度最高。从Chao1指数来看，各个处理的Chao1指数值均较高，其中CA3的Chao1指数值最高，显著高于对照，说明CA3处理的细菌丰富度最高。在Simpson指数和Shannon指数方面，CA3的指数值均为最高，说明CA3具有较高的细菌丰富度和均匀度，但是各处理之间没有显著性差异。以上结果说明，2.5mmol·kg－1的柠檬酸处理显著增加了细菌群落多样性。
表1 根际土壤细菌α多样性指数分析
注: 同列数据后无相同小写字母表示不同处理间差异显著 ( P＜0. 05) 。
2.3 β多样性分析
β多样性是不同生态系统之间多样性的比较，是物种组成沿环境梯度或者在群落间的变化率，用来表示生物种类对环境异质性的反应。对不同浓度柠檬酸处理的亚麻根际土壤样本的OTU组成进行PCoA分析(图2)，提取了2个主成分因子用来显示细菌群落特征。结果表明，PCo1是造成处理间差异性的最主要因素，解释度为30.38%;PCo2是造成处理间差异性的次要因素，解释度为23.85%;这两个因素共解释了样本54.23%的信息。其中CA3与对照的距离最远，说明CA3的土壤细菌OTU组成与对照土壤细菌OTU组成之间的群落结构差异最大。
图2 根际土壤细菌PCoA分析
2.4 物种组成分析
不同分类水平能够具体反映土壤微生物的群落结构状态，因此，本研究对细菌菌群组成分别在门分类水平及属分类水平进行了分析。
在不同柠檬酸浓度处理下，亚麻根际土壤细菌门水平的优势菌群为髌骨细菌门(Patescibacteria)、变形杆菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidota)、蓝藻门(Cyanobacteria)、放线菌门(Actinobacteriota)、酸杆菌门(Acidobacteriota)、粘菌门(Myxococcota)等8个门，其中髌骨细菌门在所有样品中均为优势菌门，平均占比为49.50%(图3)。髌骨细菌门、变形杆菌门和厚壁菌门为CK、CA1、CA2中的优势菌门，在CK中的占比分别为35.12%、23.62%、26.31%，在CA1中的占比分别为60.99%、12.31%、10.61%，在CA2中的占比分别为62.48%、11.27%、11.48%;髌骨细菌门、变形杆菌门和拟杆菌门为CA3中的优势菌门，占比分别为39.39%、21.84%、25.45%。
进一步从细菌属水平上进行分析，结果显示，在不同柠檬酸浓度处理下，亚麻根际土壤的优势菌属为TM7a、芽孢杆菌属(Bacillus)、异源根瘤菌新根瘤菌-副根瘤菌属(Allorhizobium-NeorhizobiumPararhizobium-Ｒhizobium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、成对杆菌属(Dyadobacter)、金黄杆菌属(Chryseobacterium)、肠杆菌属(Enterobacter)、鞘脂杆菌属(Sphingobacterium)、假黄单胞菌属(Pseudoxanthomonas)、黄杆菌属(Flavobacterium)、纤维菌属(Cellvibrio)、甲基菌属(Methylobacillus)、等12个属，其中TM7a是所有样品中的优势菌属，平均占比为32.99%(图4)。TM7a和芽孢杆菌属为CK、CA1、CA2中的优势菌属，在CK中的占比分别为28.38%、26.31%，在CA1中的占比分别为39.28%、10.61%，在CA2中的占比分别为36.86%、11.48%;TM7a和异源根瘤菌-新根瘤菌-副根瘤菌属为CA3中的优势菌属，占比分别为27.46%、13.24%。
图3 根际土壤细菌群落在门水平上的组成和
图4 根际土壤细菌群落在属水平上的组成和相对丰度
3 结论与讨论
低分子量有机酸是土壤本身含有并且广泛存在的一类物质，来源渠道主要有微生物合成、动植物残体的分解以及植物自身根系分泌等［11］。低分子量有机酸在土壤环境中具有重要意义，能够参与成土作用、改变植物根际土壤理化性质、改善植物对土壤养分的吸收、降低重金属等有害元素对植物的伤害等［12］。柠檬酸是一种天然低分子量的有机酸，其天然属性使其拥有易生物降解、环境风险小等特点。多项研究表明，柠檬酸能够促进植物对土壤重金属的吸收，缓解重金属对植物的毒害作用。李华英［13］发现，外源添加柠檬酸，苎麻生物量增大，根系活力上升，Cd积累量增加，缓解了Cd的毒害作用;郭晖等［14］研究表明，外源添加柠檬酸提高了鸢尾(Iris tectorum Maxim．)、萱草(Hemerocallis fulva)和美人蕉(Canna indica L．)对铅(Pb)污染土壤的修复效率，这3种观赏植物生长量也有所增加;姚琴等［15］发现，外源添加柠檬酸能够提高蜈蚣草的抗氧化酶活性和根系活力，降低膜脂的过氧化水平，进而提高了其对锑的耐受能力，缓解了锑(Sb)的毒害作用。
植物根际微生物多样性的研究有助于加强对微生物与植物之间互作关系的了解，土壤多样性指数对微生物群落变化具有指示作用［16］。在本研究中，CA3的ACE和Chao1指数与对照相比显著增加，说明在2.5mmol·kg－1的柠檬酸处理下，Cd污染亚麻根际土壤的细菌丰度最大;此外，在各处理中，CA3的Simpson和Shannon指数值均为最高，但是各处理间没有显著性差异，说明CA3的细菌丰富度和均匀度较高。采用β多样性分析探究各处理之间群落结构的相似性，发现与对照相比，CA3的土壤细菌OTU组成差异最大，CA1次之，说明在2.5 mmol·kg－1的柠檬酸处理下，Cd污染亚麻根际土壤的细菌OTU组成变化最大。在物种组成方面，髌骨细菌门在所有处理中均为优势菌门，CK、CA1、CA2中占比大于10%的优势菌门为髌骨细菌门、变形杆菌门和厚壁菌门，而CA3中占比大于10%的优势菌门则为髌骨细菌门、变形杆菌门和拟杆菌门;TM7a是所有处理中的优势菌属，CK、CA1、CA2中占比大于10%的优势菌属为TM7a和芽孢杆菌属，CA3占比大于10%的优势菌属为TM7a和异源根瘤菌－新根瘤菌－副根瘤菌属。从以上结果可以看出，在不同柠檬酸浓度处理下，CA3的Cd污染亚麻根际土壤的细菌多样性和丰度显著增加，细菌组成方面的差异也最大。本研究有助于从根际微生物的角度为后期深入探究柠檬酸对亚麻Cd吸收的影响奠定基础。
参考文献
[1]任泺彤，陈小光，马颜雪，等．麻文化发展与高值利用前景展望［J］．中国麻业科学，2021，43(5):272-280．
［2］柳婷婷，骆霞虹，李文略，等．不同亚麻品种重金属Cd吸收积累的差异［J］．浙江农业科学，2022，63(9):2030-2032，2045．
［3］刘丽丽，李建辉，郑雪良，等．早实薄皮核桃根际与非根际土壤微生物多样性分析［J］．浙江农业科学，2022，63(7):1487-1489．
［4］胡群群，李志安，黄宏星，等．柠檬酸促进土壤镉解吸的机理研究［J］．生态环境学报，2011，20(S2):1338-1342．
［5］詹淑威，潘伟斌，赖彩秀，等．外源有机酸对小飞扬草(Euphorbia thymifolia L．)修复镉污染土壤的影响［J］．环境工程学报，2015，9(10):5096-5102．
［6］薛博晗，李娜，宋桂龙，等．外源柠檬酸、苹果酸和草酸对披碱草镉耐受及富集的影响［J］．草业学报，2018，27(6):128-136．
［7］陈红纯，吴科君，李瑞，等．外源有机酸对镉胁迫下秋华柳镉积累特征的影响［J］．生态学报，2019，39(12):4510-4518．
［8］杨波，陈银萍，柯昀琪，等．EDDS对Cd胁迫下三叶鬼针草生长和抗氧化酶系统及Cd积累的影响［J］．农业环境科学学报，2018，37(5):875-882．
［9］GUO M J，WU F H，HAO G G，et al．Bacillus subtilis improvesimmunity and disease resistance in rabbits［J］．Frontiers inImmunology，2017，8:354．
［10］邹丽娜，柳婷婷，李文略，等．麻地膜覆盖对番茄根际土壤微生物群落结构的影响［J］．浙江农业科学，2023，64(2):371-378．
［11］JONES D L，DENNIS P G，OWEN A G，et al．Organic acidbehavior in soils-misconceptions and knowledge gaps［J］．Plantand Soil，2003，248(1):31-41．
［12］丁永祯，李志安，邹碧．土壤低分子量有机酸及其生态功能［J］．土壤，2005，37(3):243-250．
［13］李华英．外源柠檬酸和草酸对镉胁迫下苎麻生理响应的影响研究［D］．长沙:湖南大学，2014．
［14］郭晖，庄静静．外源柠檬酸对3种观赏植物修复铅污染土壤的影响［J］．西南农业学报，2021，34(1):137-143．
［15］姚琴，杨爱江，牛阿萍，等．两种外源有机酸对蜈蚣草修复锑污染土壤的影响［J］．环境科学学报，2022，42(8):405-414．
［16］ONEN O I，ABOH A A，MFAM A N，et al．Microbialdiversity:values and roles in ecosystems［J］．Asian Journal ofBiology，2020:10-22．
文章摘自：柳婷婷,李文略,骆霞虹,等.柠檬酸对镉污染土壤中亚麻根际微生物的影响[J].浙江农业科学,2025,66(05):1145-1150.DOI:10.16178/j.issn.0528-9017.20240161.
