摘  要：本发明属于植物病毒检测技术领域，具体涉及一种工业大麻双分体病毒基因及其应用，所述病毒基因有两条dsRNA，dsRNA1序列如SEQ ID NO:1所示，dsRNA2序列如SEQ ID NO:2所示，本发明提供了工业大麻双分体病毒基因序列，利用本发明提供的序列，采用现有技术手段，制备的用于检测该病毒的引物、试剂盒或者抗体蛋白等可以用于培育脱毒工业大麻种苗，优质工业大麻种子检测，工业大麻病害检测等多个场景中，对该病害进行快速诊断和及时防控。

 

权利要求书

1.一种工业大麻双分体病毒基因，所述病毒基因有两条dsRNA，dsRNA1序列如SEQ ID NO:1所示，dsRNA2序列如SEQ ID NO:2所示。

2.一种检测双分体病毒基因的产品，其特征在于，所述病毒基因有两条dsRNA，dsRNA1序列如SEQ ID NO:1所示，dsRNA2序列如SEQ ID NO:2所示。

3.根据权利要求2所述的产品，其特征在于，所述产品为特异性引物。

4.根据权利要求3所述的产品，其特征在于，检测dsRNA1的特异性引物序列如SEQ ID NO:3、4、9或11所示；检测dsRNA2的特异性引物序列如SEQ ID NO:5、6、7、8、10、或12所示。

5.根据权利要求2所述的产品，其特征在于，所述产品为试剂盒。

6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于，所述试剂盒含如SEQ ID NO:3～12所示任一条引物序列。

7.权利要求26任一所述产品在培育脱毒工业大麻种苗、优质工业大麻种子检测或工业大麻病害检测中的应用。

8.双分体病毒基因在制备检测工业大麻双分体病毒的引物、探针或试剂盒，或用于表达载体构建，基因编辑，或用于制备抗工业大麻双分体病毒抗体中的应用，其特征在于，所述病毒基因有两条dsRNA，dsRNA1序列如SEQ ID NO:1所示，dsRNA2序列如SEQ ID NO:2所示。

9.一种工业大麻双分体病毒基因的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提取待测样品总RNA；

（2）使用逆转录酶将提取的RNA逆转录成cDNA；继续以cDNA为模板，在DNA多聚酶的作用下进行PCR扩增克隆、测序，得到特异片段；

（3）通过电泳分析PCR产物或者在PCR过程中加入荧光探针或染料，通过分析荧光信号的变化来确定样品中病毒RNA的存在和相对量；所述病毒基因序列如SEQ ID NO:1和/或如SEQ ID NO:2所示。

10.一种分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为病毒基因逆转录获得的cDNA,所述病毒基因序列如SEQ ID NO:1和/或如SEQ ID NO:2所示。

 

技术领域

本发明属于植物病毒检测技术领域，具体涉及一种工业大麻双分体病毒基因及其应用。

 

背景技术

工业大麻（Industrial Hemp）是指大麻植株干物质中四氢大麻酚（THC）含量低于0.3％的大麻品种类型。工业大麻全身都是“宝”，茎可以制成植物纤维，花叶提取CBD，籽可以提炼食用油、蛋白粉，可以制成中药材用在化妆品中，工业大麻在多个领域的广泛的应用正逐步被人们认识、开发及利用。云南是我国允许工业大麻种植的两个省份之一，在公安的监管下可合法推广利用，工业大麻种植遍及13个州的38个县，种植中发现工业大麻出现花叶黄化，叶片褪绿、明脉小叶、叶片矮缩、植株死亡等症状，给工业大麻的质量和产量带来了一定的损失，经过研究发现了导致病害发生的是一种双分体病毒。

双分体病毒（Partitiviridae）是一类具有双链RNA（dsRNA）基因组的病毒，基因组片段长度约为1.32.5 kb，两条dsRNA每条都有且只有1个开放阅读框，dsRNA1负责编码RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp），而dsRNA2主要负责编码衣壳蛋白（cp）。双分体病毒已被证明感染广泛的宿主，包括植物、真菌和原生动物，被侵染的植物、作物产量、品质会下降，双分体病毒通过垂直传播将病毒从母体遗传到子代，在无性繁殖和有性繁殖中均存在。在无性繁殖中，母体的根、茎、叶、愈伤组织等均含有病毒，采用根、茎、叶、愈伤组织进行培养后，新生一代植株会携带病毒。大多数的高等植物均为有性繁殖，在此过程中如母体带有病毒，病毒则会跟随种子进行传播。病毒的防治及其困难，至今尚无完全有效的方法，因此，分离、鉴定工业大麻双分体病毒及其基因组是对该病害进行快速诊断，加强病毒的早期检测，是培育无毒工业大麻种苗，预防与控制工业大麻病毒病的重要手段。

 

发明内容

本发明的目的在于提供一种工业大麻双分体病毒基因，以及提供该工业大麻双分体病毒基因的应用，具体的，本发明提供以下技术方案：

一方面本发明提供一种工业大麻双分体病毒基因，所述病毒基因有两条dsRNA，dsRNA1序列如SEQ ID NO:1所示，dsRNA2序列如SEQ ID NO:2所示。

进一步的，本发明提供一种检测双分体病毒基因的产品，所述病毒基因有两条dsRNA，dsRNA1序列如SEQ ID NO:1所示，dsRNA2序列如SEQ ID NO:2所示。

进一步的，所述产品为特异性引物。应当能理解的是，本领域技术人员通过本发明提供的病毒基因序列，根据相应的检测方法，利用使用在线工具如Primer3、SnapGene、Benchling等进行符合检测原理的引物设计。

本发明的基因组全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

在一个具体实施例中，所述的产品中，检测dsRNA1的特异性引物序列如SEQ ID NO:3、4、9或11所示；检测dsRNA2的特异性引物序列如SEQ ID NO:5、6、7、8、10、或12所示。

进一步的，所述产品为试剂盒。所述试剂盒含如SEQ ID NO:3～12所示任一条引物序列，在一个具体的实施方式中，所述试剂盒为RT反应试剂盒，包括引物、逆转录酶、RT反应缓冲液和底物等试剂，在另一个具体的实施方式中，所述试剂盒为PCR反应试剂盒，包括引物、Tag DNA聚合酶、PCR反应缓冲液和底物等试剂。

进一步的，本发明提供所述产品在培育脱毒工业大麻种苗、优质工业大麻种子检测或工业大麻病害检测中的应用。

进一步的，本发明提供双分体病毒基因在制备检测工业大麻双分体病毒的引物、探针或试剂盒，或用于表达载体构建，基因编辑，或用于制备抗工业大麻双分体病毒抗体中的应用，所述病毒基因有两条dsRNA，dsRNA1序列如SEQ ID NO:1所示，dsRNA2序列如SEQ ID NO:2所示。在一些具体的实施方式中，本发明的提供的工业大麻双分体病毒基因即病毒抗原或其抗原性片段，可用于免疫试验来检测抗体水平(或相反，可用抗病毒抗体来检测抗原水平)。根据明确的免疫试验，可以开发重组抗原，以代替侵入性诊断方法。可检测工业大麻样品中病毒蛋白或其片段的抗体。免疫试验的设计可作很大变化，其各种方案均是本领域中已知的。免疫试验的方案可基于例如竞争性、或直接反应或夹心型试验。方案例如还可采用固体支持物，或可以采用免疫沉淀法。大多数试验涉及采用标记的抗体或多肽；该标记例如可以是荧光标记、化学发光标记、放射活性标记或染料分子。扩增探针信号的试验也是已知的；其例子是采用生物素和亲和素的试验，酶标记的和介导的免疫试验，如ELISA试验。

进一步的，本发明提供一种工业大麻双分体病毒基因的检测方法，包括以下步骤：

（1）提取待测样品总RNA；

（2）使用逆转录酶将提取的RNA逆转录成cDNA；继续以cDNA为模板，在DNA多聚酶的作用下进行PCR扩增克隆、测序，得到特异片段；

（3）通过电泳分析PCR产物，观察是否有与预期大小相符的条带出现，以此判断样品中是否含有目标病毒RNA；或者使用qRTPCR，即在PCR过程中加入荧光探针或染料，通过分析荧光信号的变化来确定样品中病毒RNA的存在和相对量。

所述病毒基因序列如SEQ ID NO:1和/或如SEQ ID NO:2所示。

进一步的，本发明提供一种分离的核酸分子，所述核酸分子为病毒基因逆转录获得的cDNA,所述病毒基因序列如SEQ ID NO:1和/或如SEQ ID NO:2所示。

本发明达到的技术效果：工业大麻病毒在工业大麻上引起工业大麻花叶黄化，叶片褪绿、叶片矮缩、花叶发育不良致使大麻死亡等症状，给工业大麻种植企业带来了严重的经济损失，本发明通过病害植株宏观基因组测序，并将基因组序列比较分析，鉴定并分离获得了引起工业大麻病害的工业大麻双分体病毒，该病毒是发明人首次从病害工业大麻分离获得的病毒，该病毒的基因组序列信息及功能基因国内外还未见报道。该病毒基因组序列的获得对了解病毒来源、进化过程及分子流行病学有重要意义，同时也为该病害鉴别诊断以及抗病基因的研制奠定了基础，具有巨大的经济和社会效益。

本发明提供了工业大麻双分体病毒基因序列，利用本发明提供的序列，采用现有技术手段，制备用于检测该病毒的引物、试剂盒或者抗体蛋白等，可以用于培育脱毒工业大麻种苗，优质大麻种子检测，大麻病害检测等多个场景中，对该病害进行快速诊断和及时防控。

 

附图说明

图1为本发明从种植大田采集的感染双分体病毒的工业大麻植株性状图；

  

图1

图2为本发明于实验室接种双分体病毒后的工业大麻植株性状图。

  

图2

 

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明所提供的工业大麻双分体病毒基因序列为两条dsRNA，dsRNA1序列如SEQ ID NO:1所示，dsRNA2序列如SEQ ID NO:2所示，根据高通量测序分析结果获得与各病毒有关的contigs序列，通过NCBI对这些contigs进行BLAST比对，从结果中选择序列一致性最高的同源病毒作为参考序列，使用软件Premier 5并基于病毒contigs基因组序列针对性地设计几对特异性引物扩增大麻双分体病毒并验证从头组装的病毒序列的正确性（表1）。根据本发明病毒基因序列和引物，可选择性的采用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）、多重实时荧光定量PCR（RTqPCR）等技术对待测工业大麻样品进行检测。

以下以具体实施例对本发明做进一步的说明：

实施例1

大麻双分体病毒检测和验证

1.材料

于云南省小哨基地采集2份大麻样品，一份表现为叶片褪绿、明脉小叶、矮缩；另一份表现为花叶黄化、褪绿（图1）。

2.RTPCR、RACE和测序

2.1 RTPCR

（1）工业大麻样品总RNA提取和逆转录

采用Eastep®Super总RNA提取试剂盒（Promega，上海）提取大麻样品总RNA,采用Hifair®III Ist Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester plus)(翌圣,上海,中国)进行反转cDNA。

（2）PCR反应

PCR反应体系(50uL):

2×Hiffer®Robust PCR master Mix(翌圣,上海,中国)25uL，

VCVRNA1F/VCVRNA21F/VCVRNA22F分别各(10 pmol/L)1uL，

VCVRNA1R/VCVRNA21R/VCVRNA22R分别各(10 mol/L)1 uL，

cDNA模板5 uL,

ddH2 0 18 uL。

扩增条件:94℃预变性3 min;94℃变性10s,56℃退火20s,72℃延伸30s,33个循环;72℃延伸5min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后进行纯化回收，送至北京擎科生物科技有限公司昆明分公司测序。测序返回序列利用DNAMAN 5.0进行序列处理、分析和序列拼接，从而得到2条大麻双分体病毒dsRNA1序列如SEQ ID NO:1所示，dsRNA2序列如SEQ ID NO:2所示。

2.2 RACE验证

按照制造商的说明，使用SMARTerRACE5′/3′试剂盒（艾科瑞，中国湖南）根据设计的5′RACE特异性引物（SEQ ID NO:11或12）和3′RACE特异性引物（SEQ ID NO:9或10），具体序列参见表1，扩增大麻双分病毒的5'和3'末端序列。

首先使用艾科瑞生物工程（湖南）股份有限公司的试剂盒Evo MMLV RTase for RACE进行逆转录合成第一链cDNA。将总RNA转换成cDNA，3′RACE cDNA 20uL的反应体系包括2uL总RNA、1uL 3’RACE RT Primer、8.5uL Nuclease free water;5′RACE cDNA 20uL的反应体系包括2uL总RNA、1uL 5’RACE RT Primer、7.5uL Nuclease free water,随后72℃保温3min，冰上静置两分钟。分别在11.5uL 3′RACE cDNA和10.5uL 5′RACE cDNA体系中分别加入4uL 5X RACE RT Buffer、2uL dNTP Mix、0.5uL RNase Inhibitor、2uL Evo MMLV RTase for RACE，在5′RACE cDNA额外加入1uL Template Switching Oligo，构成20ul体系，并于42℃保温90min、72℃保温15min。

随后使用cDNA与大麻双病毒设计5′和3′特异性引物进行PCR，50uL反应中包含3uL cDNA、1uL Universal Short Primer、1uL 5′特异引物（SEQ ID NO:11或12）和3′特异引物（SEQ ID NO:9或10）、20uL 5X LExp Taq PCR Buffer、0.5uL LExp Taq HS DNA Polymerase、2uL dNTP Mix、20.5uL ddH₂0。

扩增条件:94℃预变性1 min;94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸3min,30个循环;72℃延伸5min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后进行纯化回收，并连接到pMD18T克隆载体(TaKaRa)上，之后热激转化到大肠杆菌DH5a(TaKaRa)中。在含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上进行筛选后，送至北京擎科生物科技有限公司昆明分公司测序。利用DNAMAN 5.0进行序列处理、分析,获得完整得5'和3'序列。通过序列比对和分析，结果表明本发明提供的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2序列是正确的。

表1 RTPCR扩增大麻双分体病毒引物

  

实施例2

工业大麻双分体病毒检测方法

一种工业大麻双分体病毒基因的检测方法，包括以下步骤：

（1）提取待测样品总RNA：采用Eastep®Super总RNA提取试剂盒（Promega，上海）提取大麻样品总RNA,

（2）使用逆转录酶将提取的RNA逆转录成cDNA，采用Hifair®III Ist Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester plus)(翌圣,上海,中国)进行反转cDNA；继续以cDNA为模板，在DNA多聚酶的作用下进行PCR扩增克隆、测序，得到特异片段；PCR反应体系(50uL):

2×Hiffer®Robust PCR master Mix(翌圣,上海,中国)25uL，

VCVRNA1F/VCVRNA22F分别各(10pmol/L)1uL，

VCVRNA1R/VCVRNA22R分别各(10mol/L)1 uL，

cDNA模板5uL,

ddH₂0 18uL。

扩增条件:94℃预变性3 min;94℃变性10s,56℃退火20s,72℃延伸30s,33个循环;72℃延伸5min。

（3）通过1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，观察是否有与预期大小相符的条带出现，以此判断样品中是否含有目标病毒RNA。

采用上述方法，通过对20个接种病毒的工业大麻（图2）样品进行检测，检测结果均与预期一致，说明建立的RTPCR检测技术体系可以用于工业大麻田间样品的病毒检测。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，然其并非用以限制本发明。相关领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此凡采取等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

 

文章摘自国家发明专利，一种工业大麻双分体病毒基因及其应用，发明人：许艳萍，郑宽瑜，陈璇，杨明，苏晓霞，吕品，贾永，张园，字雪靖，张庆滢，郭蓉，杨若菡，申请号：202510445885.4，申请日：2025.04.10