摘 要：描述了一种用于提取基于大麻的植物化合物的发酵方法。该方法利用葡萄酒或啤酒酵母来发酵大麻花，得到富含基于大麻的植物化合物的大麻糟卤。
权利要求书
1.一种用于提取基于大麻的植物化合物的方法，所述方法包括：
提供酵母发酵剂，所述酵母发酵剂包含酵母、糖和水；
使所述酵母发酵剂发酵足以提供第一发酵培养基的第一时间段，由此所述酵母增殖；
向所述第一发酵培养基中添加大麻以提供第二发酵培养基；
以及使所述第二发酵培养基发酵一段时间以提供包含基于大麻的植物化合物的大麻糟卤。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述酵母是酿酒酵母。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述糖的量为所述酵母的重量的10倍
至30倍，或优选地所述酵母的重量的15倍至20倍。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一发酵培养基具有0.1％至5％(v/v)的乙醇含量。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中第一时间段为约24小时至48小时。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述酵母发酵剂在约72℉至75℉的温度下发酵。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述大麻包括工业大麻或毒品大麻的花。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述大麻的干重为所述酵母的量的0.5倍至5倍(按重量计)，优选地，所述大麻的干重为所述酵母的量的1倍至3倍(按重量计)。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二发酵培养基以有氧方式发酵至多5天，随后以无氧方式发酵至少2至3个月。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述大麻是工业大麻并且所述大麻糟卤含有植物大麻素，包括CBD、CBG、CBD?a或它们的混合物。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述大麻是毒品大麻并且所述大麻糟卤含有植物大麻素，包括THC、THC?a或它们的混合物。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述大麻糟卤还包含磷脂。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括分离所述大麻糟卤。
14.一种大麻糟卤，所述大麻糟卤通过根据权利要求1至13中任一项所述的方法制备。
15.一种饮料，所述饮料包含根据权利要求14所述的大麻糟卤。
16.一种食料，所述食料包含根据权利要求14所述的大麻糟卤。
技术领域
本公开涉及通过酵母发酵从新鲜和干燥的大麻植物中天然提取基于大麻的植物化合物(例如大麻素、萜烯和酚类化合物)。
背景技术
大麻植物(包括毒品大麻(marijuana)和工业大麻(hemp))含有不同量的大麻素如大麻二酚(CBD)、大麻萜酚(CBG)和四氢大麻酚(THC)，已知这些大麻素具有有益的精神活性作用和药物作用。已知其他活性组分诸如萜类化合物和黄酮类化合物除了提供风味外还协同地促进这些有益效果。大麻的所有不同组分之间的复杂协同作用也被称为“随从”效应。
大麻素提取物典型地通过各种提取方法获得，这些提取方法包括超临界CO2、醇提取和丁烷或丙烷提取等等。然而，一些挥发性或反应性化合物(包括风味萜烯)在提取条件下可能(例如通过蒸发)降解和损失或以化学方式变化(例如降解)为不同物质。
然而，需要开发不涉及加热并且不涉及苛刻的工业化学提取方法的天然植物制剂，特别是整株植物制剂。
发明内容
本文公开了捕获整株大麻花中存在的全部活性植物化合物的天然提取方法，因此提供整株植物的某些有益效果或涉及苛刻的工业化学提取方法。具体地，该方法包括逐步发酵大麻(例如整株大麻花)，致使一种或多种大麻素或其他植物化合物从大麻中提取出来并在“大麻糟卤”内富集，“大麻糟卤”是包含发酵副产物诸如死酵母细胞的天然形成的悬浮液培养基。
因此，一个实施方案提供了一种用于提取基于大麻的植物化合物的方法，该方法包括：提供酵母发酵剂，该酵母发酵剂包含酵母(Saccharomyces)、糖和水；使酵母发酵剂发酵足以提供第一发酵培养基的第一时间段，由此酵母增殖；向第一发酵培养基中添加大麻以提供第二发酵培养基；以及使第二发酵培养基发酵一段时间以提供包含基于大麻的植物化合物的大麻糟卤。
附图说明
示例性实施方案示于附图。预期本文公开的实施方案和附图被认为是说明性的而不是限制性的。
图1描绘了提供根据一个实施方案的发酵过程的概述的流程图。
图1
图2示出了所发酵的大麻花的容器，其中大麻糟卤在容器的底部形成。
图2
具体实施方式
本文公开了一种将发酵和提取组合以提供所提取的基于大麻的植物化合物的方法。该方法通过提取天然存在于给定大麻植株中的一系列植物化合物诸如大麻素、黄酮类化合物和萜烯，向所得发酵饮料的消费者提供具有协同有益效果的随从效应，从而保留了摄食整株植物的随从效应。
有利地，发酵过程产生乙醇，其用作提取介质以从大麻植物(优选地整朵花)中提取植物化合物。此外，随着发酵进行，形成大麻糟卤。大麻糟卤是发酵过程的副产物的悬浮液，这些副产物包括来自死亡或分解的酵母细胞的复杂天然分子(例如，蛋白质、脂肪酸、多糖、酶等)。令人惊讶地发现大麻糟卤具有显著的增溶和乳化能力。用乙醇提取的植物化合物被富集和共悬浮在大麻糟卤中，这些大麻酒糟可容易地与发酵液的其余部分分离。
如图1所示，天然提取过程(100)从第一发酵步骤开始，在该步骤中酵母(例如酿酒酵母(Saccharomyeces cerevisiae))被再水合并用水和糖活化以形成酵母发酵剂(102)。第一发酵步骤(104)致使酵母细胞增殖并初始产生乙醇，得到第一发酵培养基(106)。典型地，第一发酵步骤以有氧方式进行以产生稳健的酵母发酵剂。乙醇也作为发酵产物产生。典型地，乙醇含量小于第一发酵培养基的5％v/v，或更典型地小于3％v/v。在一些实施方案中，初始乙醇含量为0.1％v/v至5％v/v，或更典型地为1％v/v至3％v/v。
然后将大麻花(108)添加到第一发酵培养基(106)中以提供第二发酵培养基(110)。在第二发酵步骤期间，连续地产生乙醇，这提供了提取培养基。在发酵期间，乙醇含量可以高达8％，更典型地可以高达5％。将大麻(包括新鲜的、干燥的或风化的花，或脱羧的花)在首先有氧然后无氧的条件下发酵(112)足够长的时间以允许全面广谱的基于大麻的植物化合物的天然提取(116)。
任选地，可以向第二发酵培养基中添加额外的酵母(酿酒酵母)(114)，该第二发酵培养基可以具有1％至3％的起始乙醇含量。额外的啤酒酵母增强了酒精发酵并将乙醇含量增加例如至4.5％至8％(v/v)。更高的乙醇含量提高了从大麻中提取萜类化合物和大麻素的效率。
随着第二发酵步骤的进行，大麻糟卤形成并收集在容器的底部。通常存在于酿酒中的糟卤是在发酵结束时沉淀到容器底部的死酵母细胞和其他颗粒的沉积物。类似地，如本文所用，“大麻糟卤”是指大麻发酵副产物，诸如死亡或失活的酵母细胞和其他细颗粒或沉淀物。具体地，糟卤由死酵母细胞以及来自分解的酵母细胞的细胞组分组成，这些细胞组分包括蛋白质(例如甘露糖蛋白)、多糖(葡聚糖)、酚类化合物、酶、脂肪酸(例如磷脂)和氨基酸。
因此，大麻糟卤是具有增溶和乳化能力的非均相悬浮液，其中富含所提取的大麻植物化合物。在一些实施方案中，所提取的植物化合物可以进一步发生酶促转化以提供活性更高或可生物利用度更高的化合物。
因此，大麻发酵产生基于大麻的活性植物化合物(例如，大麻素、萜烯和酚类化合物)的复杂混合物，这些活性植物化合物是从大麻花中提取的，从而保留了摄食整株植物的随从效应。另外，第二发酵产生酿酒酵母酶，这些酶引起从大麻花中提取的基于大麻的植物化合物的酶促水解，以使这些植物化合物的可生物利用度更高。具体地，第二发酵将约50％的非活性大麻素脱羧为生物活性大麻素(例如，发现非活性CBD?a脱羧为生物活性CBD)。
本文更详细地描述了本公开的这些和其他方面。
第一发酵步骤?酵母起始培养
如本文所用，酵母发酵剂是指在水中活跃增殖的酵母细胞，其中糖作为酵母培养的食物来源。
合适的酵母是葡萄酒酵母或啤酒酵母，包括例如酵母属及其任何一种菌种(例如酿酒酵母；贝酵母(S.bayanus)；布拉氏酵母(S.boulardii)；巴斯德酵母(S.pastorianus)；库德里阿兹威酵母(S.kudriavzevii)；葡萄汁酵母(S.uvarum)；真贝酵母(S.eubayanus))。
在优选的实施方案中，使用酿酒酵母。酿酒酵母是食品和饮料发酵中最常用的酵母菌种。酿酒酵母也被称为啤酒酵母或面包酵母，其所有菌株均发酵糖(作为底物)以产生乙醇和二氧化碳。
可以使用任何类型的糖，包括例如蔗糖。典型地，糖的量是酵母的约10倍至30倍(按重量计)。更典型地，糖的量是酵母的量的约15倍至20倍(按重量计)。
因此，酵母起始培养通过酿酒酵母在已过滤温水(例如，约72°F至75°F)中的再水合引发。酵母与水的重量比可以在1％w/v至5％w/v的范围内，更典型地在1％w/v至3％w/v的范围内。
起始培养是酵母生命周期的第一阶段，其涉及酵母群体的生长。一旦酵母细胞培养物达到临界质量，就进行酒精发酵。优选地将酵母发酵剂置于环境室温(例如，约68°F至78°F)的黑暗环境中保持24小时至48小时，以有氧方式成指数增加酵母群体，并伴有抑制有害细菌和霉菌生长的潜在有益效果。
在第一发酵步骤期间有可能初始产生乙醇。典型地，在该阶段乙醇的量为约0.1％v/v至5％v/v。更典型地，乙醇含量为约0.1％v/v至4％v/v，或甚至更典型地为0.5％v/v至4％v/v、1％v/v至4％v/v、1％v/v至3％v/v、1％v/v至2％v/v等等。
第二发酵步骤?添加大麻
在第一发酵步骤进行24小时至48小时后，将大麻花(例如，干燥风化的和/或新鲜的大麻花)添加到酵母发酵剂中以制备第二发酵培养基。大麻花的量(干重)可以是在第一发酵步骤中添加的酵母的量的0.5倍至5倍(按重量计)，或更典型地1倍至3倍。
有氧发酵3天至5天后，可以将气锁塞置于盛有酵母发酵剂和大麻花的容器上。然后在环境室温(例如，约68°F至78°F)的黑暗环境中用酵母将大麻以有氧方式发酵2至3个月。
第二发酵培养基在对于将大麻提取物分配到发酵液中最优的条件和持续时间下进行进一步无氧发酵。如本文所用，大麻提取物可以是来源于所添加的大麻植物物质的任何化合物。典型地，添加大麻花(包括新鲜的、风化的或脱羧的花)，因为它们富含活性植物化合物诸如大麻素和萜烯。
在2至3个月的发酵期后，提取来自大麻的基于大麻的化合物并使其在容器底部聚积，形成棕褐色不透明层。该棕褐色不透明层代表大麻糟卤(与大麻素化合物和其他大麻沉淀物共悬浮的糟卤)。糟卤由含有蛋白质和分子如甘露糖蛋白、多糖、脂肪酸和氨基酸的死酵母细胞组成。不希望受理论的束缚，据信糟卤中的脂肪酸和蛋白质具有显著的增溶和乳化能力，使得有可能提取和富集亲脂性化合物诸如CBD或THC。
A.大麻
大麻是大麻科的开花植物属。除非另外指明，否则大麻广义地指该属内的任何栽培品系，包括毒品大麻和工业大麻。
毒品大麻是含有超过0.3％(干重)的主要精神活性成分四氢大麻酚(THC)的许多4/6页大麻品系的广义分类。毒品大麻(或医用大麻)主要因其大麻素成分(包括THC和CBD)被摄食，以试图治疗疾病或改善症状。大麻用于减少化疗期间的恶心和呕吐，改善HIV/AIDS患者的食欲，以及治疗慢性疼痛和肌肉痉挛。大麻素影响中风的潜力正处于初步研究中。虽然证据暂无定论，但是已尝试将毒品大麻用于治疗抑郁、焦虑、注意力缺陷多动障碍、Tourette综合征、创伤后应激障碍和精神异常。
大麻植物的某些品系被称为工业大麻，但是该术语通常用于仅指因非药物用途而栽培的大麻品种(即，以干重计具有0.3％或更低的THC含量)。长期以来使用工业大麻的大麻纤维、大麻籽及其油、大麻叶，用于药用目的。工业大麻产品由被选择用于生产大量纤维的大麻植物制成。
在大麻植物中鉴定的超过100种大麻素之中，植物大麻素主要包括大麻二酚(CBD)、四氢大麻酚(THC)、大麻萜酚(CBG)。虽然结构不同，但大麻素全部都作用于大麻素受体(例如，CB1和CB2受体)，这些大麻素受体位于整个身体中并且涉及食欲、疼痛感觉、情绪和记忆。
四氢大麻酚或THC是大麻的主要精神活性大麻素组分。THC作用于主要在脑中的CB1受体，并提供用户体验到的“高”精神活性。THC也用于治疗诸如疼痛、肌肉痉挛、青光眼、失眠、食欲低下、恶心和焦虑等病症。
在大麻植物中，THC主要作为非精神活性的四氢大麻酚酸(THC?a)存在。THC?a可通过脱羧转化为THC，这通常通过加热进行。然而，本文所述的发酵过程同时会引起将THC?a脱羧以产生THC的酶促反应。
“大麻二酚”或“CBD”是非精神活性大麻素。与THC组合时，CBD显示出一些调节特性以减少不利的THC效应。还已知CBD具有其自身的治疗特性，特别是用于治疗癫痫和最近的自闭症。由于CBD的抗抑郁和神经保护作用，其还可能有益于那些经历恶心、炎症和焦虑的人群。
在工业大麻植物中，CBD主要以CBD的羧酸形式?大麻二酚酸(“CBD?a”)存在。与THC?a一样，CBD?a也可通过在本文所述的发酵期间发生的酶促反应进行脱羧而转化成CBD。
植物萜烯是天然存在的具有不同结构的烃。虽然萜烯以植物质量的少量(小于5重量％)存在，但它们给植物提取物带来强大且理想的风味。据信萜烯还可以调节大麻素的药理学作用。
植物大麻素和萜烯聚积在腺毛的分泌腔中，并主要出现在大麻花(典型地雌株的花)中。因此，本文所公开的方法优选地利用大麻花，包括新鲜的或风化的(干燥的)花。在第二发酵步骤期间，提取大麻素和萜烯。
大麻花可以通过本领域已知的方法风化(干燥)使用。另选地，可以使用脱羧的大麻花。例如，在约100℃至120℃下将干燥的大麻花加热或烘烤60分钟至90分钟可以有效地将CBD?a和THC?a分别转化为CBD和THC。
B.发酵条件
第二发酵以有氧方式进行2天至3天，然后以无氧方式进行2至3个月。在此期间，由酵母生成的代谢物形成醇提取剂，该醇提取剂从大麻花中选择性地分离出植物大麻素和萜烯。特别地，许多大麻素具有一个或两个酚部分，该酚部分可以在醇条件下被质子化。
第二发酵产生酿酒酵母酶，这些酶引起从大麻花中提取的基于大麻的植物化合物5/6页的酶促水解，以使这些疏水性植物化合物的可生物利用度更高。酵母酶促水解允许由水解的脂质植物化合物形成胶束，从而有助于基于大麻的疏水性植物化合物的生物可及性。
在第二无氧发酵期间，由酵母连续产生乙醇。虽然第二发酵培养基以1％至3％(v/v)的乙醇含量开始，但当添加额外的葡萄酒/啤酒酵母时，在第二发酵步骤期间乙醇可高达5％至8％(v/v)。乙醇量的增加促进了大麻花的各种活性组分的提取。
在更具体的实施方案中，以2g/升至10g/升的第二发酵培养基添加大麻花(新鲜的、风化的或脱羧的)。发酵通常在无氧条件下在环境室温(例如，约68°F至78°F)下进行足够长的时间段(例如，2至3个月)。
所提取的基于大麻的植物化合物的富集和分离
发酵结束时酵母细胞的酶促水解导致富含营养物的大麻植物细胞的类似酶促水解，该类似酶促水解然后释放出许多大麻素植物化合物并使其被乳化以增加生物利用度。死酵母细胞和基于大麻的植物化合物沉淀物将沉降到最终发酵液的底部，形成大麻糟卤(掺入大麻素化合物的糟卤)。大麻糟卤含有整株大麻植物的基于大麻的植物化合物以保留随从效应。可以通过本领域已知的方法分析该大麻糟卤以确定存在的萜烯和大麻素的量。
在其他实施方案中，含有很大百分比(10％至20％)的THC的大麻花而不是低THC大麻花也可用于发酵并产生富含THC的大麻糟卤。
实施例
通过以下实施例进一步说明本公开。以下实施例是非限制性的并且仅代表本公开的各个方面。
实施例1
工业大麻花的发酵
根据本文所公开的两步法将大麻花发酵。
酵母起始培养通过在锥形瓶(1000ml)或类似容器中用500ml已过滤温水(例如，72°F至75°F)和220g糖将11.5g干燥的酿酒酵母(啤酒酵母)再水合来引发。一旦酵母达到临界质量，就进行酒精发酵。将酵母发酵剂置于环境室温(例如，约68°F至78°F)的黑暗环境中保持24小时至48小时，以通过有氧发酵增加酵母群体。
24小时至48小时后，将10g大麻花(干燥风化的)添加到酵母发酵剂中并以有氧方式发酵3天至5天。3天至5天后，将气锁塞置于锥形瓶(1000ml)或类似容器上。在环境室温(例如，约68°F至78°F)的黑暗环境中用酵母将大麻以有氧方式发酵2至3个月。定期摇动烧瓶以在此期间促进混合。
图2示出了在2至3个月的第二发酵期后在锥形瓶(200)中得到的发酵产物。如图所示，残留的大麻花(210)漂浮在顶部；水/醇层(220)在中间；并且棕褐色不透明层(230)沉降到锥形瓶的底部，其为“大麻糟卤”。通过移液将大麻糟卤与剩余的发酵液分离，对其内容物进行定量分析。
表1示出了从1个月时标记的和2个月时标记的大麻糟卤中取出的发酵样品的CBD和CBD?a的量。如图所示，不仅CBD?a以增加的趋势存在于大麻糟卤中，而且还因脱羧而导致CBD形成。
还测试了水/醇层，但显示不存在CBD或CBD?a。这表明由乙醇提取的植物大麻素最终浓缩在大麻糟卤中，据信大麻糟卤比乙醇更增溶。
作为对照，还使用水或甲醇从工业大麻花中直接提取(不经发酵)CBD。如表1所示，水提取仅产生少量CBD?a，但不产生CBD；而甲醇(工业化学品)提取从工业大麻花中产生更大量的植物化合物。
表1
ND＝未检测到；n/a＝未分析；LOQ＝定量限；总THC＝(0.877xTHC?A)+Δ9?THC；
总CBD＝(0.877x CBD?A)+CBD。*Δ8THC相比于其他大麻素具有更低的精度和更高的检测限
上述各种实施方案可以组合以提供另外的实施方案。在本说明书中提及和/或在申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利公开均以引用方式整体并入本文。如果需要，可以修改实施方案的各方面以采用各种专利、申请和公开的概念来提供另外的实施方案。
根据上述详细描述，可以对实施方案做出这些和其他改变。一般而言，在以下权利要求中，所使用的术语不应被解释为将权利要求限制于说明书和权利要求中公开的特定实施方案，而应被解释为包括所有可能的实施方案以及这些权利要求所享有的等效物的全部范围。因此，权利要求不受本公开的限制。
本申请要求2022年1月28日提交的美国临时专利申请63/304，518的优先权权益，该美国临时专利申请的全部内容以引用方式整体并入本文。
文章摘自国家发明专利，通过酵母发酵从大麻植物中天然提取基于大麻的植物化合物，发明人：史蒂夫·鹤留，申请号：202380028748.X，申请日：2023.01.27
