摘 要：本发明公开了一种用亚麻籽制作植物水溶性欧米伽3的工艺，属于生物化学技术领域。针对现有多步提取、有机溶剂与乳化剂残留、乳液稳定性差及能耗高等问题，本发明首先将热敏响应型PNIPAM-PLGA与脂肪酶通过NHS-Ester偶联，制得PEC；然后在纯水体系中将PEC、脱壳粉碎的亚麻籽粉和PBS缓冲液混合，于40℃搅拌4h，一次完成油脂提取与酶催化转酯；接着以1-2℃/min速率冷却至25℃，利用PNIPAM-PLGA的LCST相变自组装为纳米胶束，获得稳定纳米乳液；最后经透析、加入生育酚醋酸酯抗氧化及氮气置换包装，产品6个月内过氧化值增幅＜5%、无分层与异味。50L放大实验验证了本工艺的线性可放大性及长期稳定性，兼具高效、简便与产业化潜力。
权利要求书
1.一种用亚麻籽制作植物水溶性欧米伽3的工艺，其特征在于，包括以下步骤：
S1.聚合物-酶复合体（PEC）的制备：将嵌段共聚物溶解于PBS缓冲液，质量浓度为10mg/mL；
随后加入NHS-Ester对PNIPAM-PLGA的羧基进行活化后与脂肪酶在25℃下反应偶联2h后透析除去游离试剂，得到PEC悬液，随后将PEC悬液经浓缩或冻干制得PEC固形物；
S2.一锅式提取与酶催化：向反应釜中加入PEC固形物，加入的量占体系总质量的2%，加入脱壳、粉碎至80目亚麻籽粉，其加入质量占体系总质量的10%，随后加入PBS缓冲液至反应釜额定体积的80%，加热至40℃并以300rpm搅拌保持4h；
S3.温控自组装纳米乳化：反应结束后，冷却至25℃，使PNIPAM-PLGA自组装成纳米胶束；
S4.处理与稳定化：将所得纳米胶束透析24h，取出后向其加入生育酚醋酸酯，加入生育酚醋酸酯的质量占纳米胶束透析后总体质量的0.10%，氮气置换包装，获得水溶性欧米伽3纳米乳液。
2.根据权利要求1所述的一种用亚麻籽制作植物水溶性欧米伽3的工艺，其特征在于，步骤S1与S4所述透析步骤在4℃条件下用纯水进行，使用分子量截留值（MWCO）为1kDa的透析膜。
3.根据权利要求1所述的一种用亚麻籽制作植物水溶性欧米伽3的工艺，其特征在于，
所述加入NHS-Ester的量与PNIPAM-PLGA羧基的摩尔比为1.2∶1；
所述聚合物-酶复合体（PEC）中脂肪酶的偶联率为5-10%；
所述嵌段共聚物PNIPAM-PLGA中，PNIPAM与PLGA的摩尔比为3∶2，LCST为36-40℃。
4.根据权利要求1所述的一种用亚麻籽制作植物水溶性欧米伽3的工艺，其特征在于，所述脂肪酶为Novozym435，与嵌段共聚物PNIPAM-PLGA的质量比为，PNIPAM-PLGA：脂肪酶=9∶1。
5.根据权利要求1所述的一种用亚麻籽制作植物水溶性欧米伽3的工艺，其特征在于，所述PBS缓冲液浓度为10mmol/L，pH6.5-7.0。
6.根据权利要求1所述的一种用亚麻籽制作植物水溶性欧米伽3的工艺，其特征在于，S3步骤中所述冷却速率限定为每分钟1-2℃。
7.根据权利要求1所述的一种用亚麻籽制作植物水溶性欧米伽3的工艺，其特征在于，所得纳米乳液的平均粒径＜100nm，PDI＜0.2。
8.根据权利要求1所述的一种用亚麻籽制作植物水溶性欧米伽3的工艺，其特征在于，所述嵌段共聚物PNIPAM-PLGA分子量限定在20-30kDa范围。
9.根据权利要求1所述的一种用亚麻籽制作植物水溶性欧米伽3的工艺，其特征在于，所得纳米乳液在常温下即25℃储存6个月内过氧值变化＜5%。
技术领域
本发明涉及生物化学领域，具体为一种用亚麻籽制作植物水溶性欧米伽3的工艺。
背景技术
植物性欧米伽3脂肪酸以亚麻籽为主要原料，因其富含α-亚麻酸而备受关注。但现有技术在制备亚麻籽来源的水溶性欧米伽3时，普遍存在以下不足：
1.多步复杂工艺
例如，专利文献CN 112876350 A中公开了一种“一种用亚麻籽制作植物水溶性欧米伽3的工艺”的流程，具体包括：脱壳、粉碎→机械压榨→溶剂脱除→乳化→干燥等五步及以上操作，流程冗长、设备投资大、能耗高，且各步骤间需要中间分离和净化，生产效率低。
2.表面活性剂及有机溶剂残留
为获得稳定的纳米乳液，常需加入吐温-80、卵磷脂等小分子表面活性剂，或以环糊精、明胶等大分子喷雾干燥制备微胶囊。这些助剂一方面难以完全去除，另一方面可能影响产品的安全性、口感和法规合规；有机溶剂萃取后的脱溶工序也存在残留风险。
3.乳化稳定性差、易氧化
常规高剪切或超声乳化方法，所得平均粒径多在100-500nm之间，分布宽且易聚集；喷雾干燥微胶囊和冻干载体虽易于保存，却因脱水或干燥过程中的高温或真空而导致不饱和脂肪酸氧化，制品的过氧值、味道和营养活性下降。
4.绿色可持续性不足
目前多采用深共熔溶剂（DES）或超临界CO2提取相结合的分段工艺，虽能提高提取率，但仍需后续脱溶、分离或添加额外乳化剂；整体流程依赖复杂设备且溶剂回收、废液处理成本高，不利于绿色生产和循环利用。
综上所述，有关技术普遍表现为：步骤多、设备复杂、能耗高；表面活性剂和有机溶剂残留风险；乳化粒径大且稳定性差；脱水/干燥氧化严重；绿色可持续性不足，不利于循环与降本。
因此亟须一种步骤少、设备简、绿色无残留、一次完成提取—改性—纳米乳化且具有高稳定性的工艺，以满足产业化生产对于效率、安全、节能和环保的综合要求。
发明内容
针对现有制备亚麻籽来源水溶性欧米伽3存在的多步工艺繁琐、有机溶剂与乳化剂残留、乳液稳定性差以及能耗高等技术瓶颈，本发明提供了一种用亚麻籽制作植物水溶性欧米伽3的工艺，能够在纯水体系中一次性完成油脂提取、酶催化转酯与纳米乳化，显著简化流程、杜绝有机残留，并获得平均粒径＜100nm、PDI＜0.2的超细稳定纳米乳液。
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
步骤一：聚合物-酶复合体（PEC）制备
将嵌段共聚物PNIPAM-PLGA溶解于pH6.5-7.0、10mmol/L PBS缓冲液中，浓度10mg/mL；其中所述嵌段共聚物PNIPAM-PLGA，PNIPAM∶PLGA=3∶2，总分子量为20-30kDa，LCST为36-40℃。
加入NHS-Ester，加入NHS-Ester的量与PNIPAM-PLGA羧基的摩尔比为1.2∶1，随后25℃活化30min；例如分子量为25kDa的100mg PNIPAM-PLGA，对应的-COOH基团为4.0μmol，即加入对应的NHS-Ester量为4.8mg；
再按PNIPAM-PLGA与脂肪酶Novozym435质量比为9∶1加入脂肪酶，25℃偶联2h；
在4℃条件下，使用分子量截留值（MWCO）为1kDa的透析膜，用纯水透析24h，除去游离试剂得到PEC悬液，酶偶联率5-10%；随后将PEC悬液经浓缩或冻干制得PEC固形物。
步骤二：一锅式提取与酶催化
向反应釜中加入PEC固形物使其占体系总质量2%；再加入脱壳、粉碎至80目亚麻籽粉使其占体系总质量10%，最后补加PBS缓冲液至釜额定体积的80%。所述PBS缓冲液浓度为10mmol/L，pH6.5-7.0。加热至40℃，300rpm搅拌反应4h，实现油脂高效提取及原位酯交换。
步骤三：温控自组装纳米乳化
反应结束后，自40℃以1-2℃/min速率冷却至25℃，PNIPAM-PLGA链段变自组装成纳米胶束。
步骤四：后处理与稳定化
将所得纳米胶束置于1kDa透析袋中，再次于4℃、纯水中透析24h，取出后，加入生育酚醋酸酯，加入的量为纳米胶束透析后总体质量的0.10%，氮气置换包装，获得平均粒径＜100nm、PDI＜0.2、|ζ-电位|≥30mV，常温下6个月内过氧值变化＜5%的水溶性欧米伽3纳米乳液。
本发明提供一种用亚麻籽制作植物水溶性欧米伽3的工艺。具备以下有益效果：
1.工艺高度集成：一步完成提取、转酯和纳米乳化，无需有机溶剂或外加乳化剂，显著简化流程，降低设备和能耗。
2.绿色无残留：纯水体系，热敏聚合物和酶复合体兼具催化和乳化功能，避免有机溶剂和表面活性剂残留风险；PNIPAM-PLGA可逆相变后易于回收再用。
3.超细均一粒径：欧米伽3纳米乳液平均粒径＜100nm，PDI＜0.2，分散稳定，不易聚集；
4.长效抗氧化：PNIPAM壳层屏障阻隔氧气，配合生育酚防护，常温
保存6个月内过氧值变化＜5%。
5.良好线性放大性：实验室至中型规模放大均能保持90%转酯率、平均粒径为85nm、PDI为0.12及长效抗氧化性能，证明工艺具有稳定的放大可行性，适合大规模产业化生产。
本发明兼具高效、绿色、可持续和产业化潜力，满足市场对植物水溶性欧米伽3产品的安全性、稳定性和成本性能要求。
附图说明
图1为实施例1中制备样品的粒径分布图；
图1
图2为对比例1中制备样品的粒径分布图；
图2
图3为实施例2中制备样品的粒径分布图；
图3
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于此描述的其他方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性地与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1，提供了一种用亚麻籽制作植物水溶性欧米伽3的工艺，具体实施方式如下：
1.原料与试剂
表1
2.聚合物-酶复合体（PEC）制备
将100mg PNIPAM-PLGA溶解于10mL的PBS缓冲液中，在25℃温度下磁力搅拌至溶液澄清；随后加入4.8mg NHS-Ester，于25℃反应30min以活化聚合物羧基；然后在25℃、200rpm条件下轻度搅拌条件下，加入50mg脂肪酶，继续反应2h，实现聚合物-酶偶联；反应结束后，将全部反应液注入经纯水预水化即浸泡30min、换水2次的MWCO 1kDa透析膜中，封口；将透析管置于含500mL、10mM、pH6.8 PBS缓冲液的透析槽内，于4℃、50rpm下轻柔搅拌透析，每4h更换一次新鲜PBS缓冲液，共更换4次总时长16h；透析结束后，收集透析管内所得聚合物-酶复合体悬液即PEC悬液，体积10.5mL。将PEC悬液冻干或烘干，得到PEC固形物150mg，按照同样步骤制备足量PEC固形物16g。
其中Bradford蛋白定量法测偶联率的具体操作步骤如下：
a.试剂与标准品
Bradford试剂：市售原液，使用前25℃放置至平衡。
BSA标准溶液：配制1.0mg/mLBSA标准溶液。
b.标准曲线制备
取7只比色管，分别加入0、10、20、40、60、80、100μL BSA标准溶液，不足100μL的补PBS缓冲液至100μL。
每管加入1mL Bradford试剂，颠倒混匀，25℃孵育10min。
在分光光度计上以595nm波长测定吸光度（A595），绘制A595与BSA浓度曲线，线性拟合得标准曲线方程。y=0.0086x+0.02(R²=0.999)
c.样品测定
取透析后PEC悬液100μL，加900μL PBS缓冲液稀释10倍；再取100μL稀释液加入1mLBradford试剂，测得A595=0.35
d.偶联率计算
偶联率（%）＝（PEC复合体中测得的蛋白量/投料蛋白总量）×100%。
其中，投料蛋白总量＝反应前加入的脂肪酶总量（mg）。
PEC复合体中测得的蛋白量＝Cs×样品总体积（mL）。
本实施例中，稀释后样品浓度Cs=(0.35-0.02)/0.0086=38.4μg/mL，总偶联蛋白量=38.4μg/mL×10.5mL×10=4.03mg，偶联率=(4.03mg/50mg)×100%≈8.06%。
Cs为稀释10倍后浓度→原始浓度=38.4×10=384μg/mL→总蛋白=384μg/mL×10.5mL=4032μg=4.03 mg.
2.一锅式提取与酶催化
表2
在1L反应釜中，将工作体积设定为800mL即占反应釜容积的80%，反应总体系定为800g；向其中依次加入16g聚合物-酶复合体（PEC）、80g亚麻籽粉，并补充704g PBS缓冲液，总质量共计800g；在40℃条件下以300rpm恒温搅拌反应4h。
4.温控自组装纳米乳化
以1.5℃/min速率从40℃冷却至25℃。
5.后处理与稳定性测试
将纳米乳液转移至MWCO 1kDa的透析袋中，于4℃下置于2L纯水中透析24h期间每8h更换一次透析液，共换水3次，随后收集透析袋内浓缩后的乳液，实测质量790g，加入生育酚醋酸酯0.79g，占乳液质量的0.1%，将加入0.79g生育酚醋酸酯的乳液在25℃下静置5min，使抗氧剂充分溶解分散；然后将其装入高压匀浆机进样口，以500bar压力循环匀浆3次，收集每次通过匀浆头后的乳液并重复进样，以确保体系获得均一的机械剪切和分散；匀浆完成后取出乳液，并以≤100rpm的温和搅拌平衡2min，即可得到均质、稳定的抗氧化纳米乳液即为本发明所述的“植物水溶性欧米伽3”。
取1mL步骤2中，一锅式提取与酶催化反应混合物，加入等体积乙酸乙酯终止反应并离心分离，收集上清并加入0.5mL甲醇与硫酸19∶1混合液，于60℃下孵育30min，干燥并定容至2ml后以仪器GC-FID测定甘油三酯与脂肪酸甲酯峰面积，按以下公式计算：
转酯率（%）=∑AFAMe/（∑ATAG+∑AFAMe）×100%；
∑AFAMe为脂肪酸甲酯峰面积，∑ATAG为甘油三酯峰面积；
测得转酯率为92%。
粒径分析：将纳米乳液用纯水按1∶20稀释并使用0.45µm注射过滤器过滤，置于Malvern Zetasizer Nano ZS动态光散射仪，25℃下测定三次，得到平均粒径Dn为85nm，PDI为0.12。
将制备好的纳米乳液用纯水按体积比1∶50稀释，并通过0.45µm注射过滤器过滤；将1mL稀释后样品注入Malvern Zetasizer Nano ZSζ-电位池，设置测量温度25℃，自动平衡2min；选择电泳光散射模式，重复测量3次每次累计10次合格数据，记录平均ζ-电位及标准偏差；测得ζ-电位=36.5mV。判定体系静电稳定性，一般|ζ-电位|≥30mV表示具有良好分散稳定性。
最后将乳液分装于棕色玻璃瓶中，氮气置换瓶顶空气，置于25℃避光保存6个月，检测过氧化值变化，且保存6个月后无分层和异味产生。
过氧化值（POV）的测定方法如下：
样品制备：精确称取纳米乳液0.05g，置于250mL棕色锥形瓶中。
溶解：加入30mL氯仿-醋酸混合溶液，其中氯仿与醋酸体积比为3∶2，颠倒混匀1min。
显色反应：加入0.5mL饱和KI溶液，避光放置1min；再加入30mL纯化水，颠倒混匀。
滴定：以0.01mol/L硫代硫酸钠标准溶液滴定至浅黄色，加入淀粉指示剂后继续滴定至无色终点，记录消耗体积V。
计算：POV(meq/kg)=V(L)×C(mol/L)×1000/m(g)
本发明所用的PNIPAM-PLGA嵌段共聚物既含疏水性的PLGA段，又含温度响应性的亲水性PNIPAM段，其自组装纳米胶束的机理如下：
1.两亲性结构
PLGA段：聚乳酸-羟基乙酸链段，对水具有疏水驱动力；
PNIPAM段：在低于LCST（38℃）时呈亲水状态，高于LCST时脱水变疏水。
2.高温酶催化期
在40℃即高于PNIPAM LCST条件下，PNIPAM脱水聚合物整体趋于非水溶性，有利于聚合物-酶复合体对亚麻籽油脂的提取与酯交换反应。
3.冷却诱导自组装
当温度以1-2℃/min速率下降至25℃即低于LCST时，PNIPAM恢复亲水性而伸展于水相，PLGA段因疏水作用相互聚集；
在水相中迅速形成“PLGA核+PNIPAM壳”结构的纳米胶束，胶束核包裹改性后的油脂，壳层形成稳定的水合层并阻隔氧气。
4.胶束稳定性
PNIPAM壳层提供立体斥力及部分静电稳定，结合后续的抗氧化剂保护，使纳米乳液平均粒径＜100nm、PDI＜0.2，长期保存6个月内过氧化值增幅＜5%。
冷却速率的控制有助于获得尺寸均一的胶束分布，适合大规模连续生产。
通过上述温控相变驱动的两亲嵌段共聚物自组装机理，本发明实现了“一锅式”提取、酶催化与纳米乳化的一体化工艺，简化流程、绿色高效，并获得超细、均一、稳定的植物水溶性欧米伽3纳米乳液。
对比例1，该对比例提供了用亚麻籽制作植物水溶性欧米伽3的传统工艺，具体实施方式如下：
1.原料处理
脱壳亚麻籽粉，80目细粉，10.0g
2.油脂提取
将脱壳粉碎后的亚麻籽粉加入100mL己烷，于25℃下磁力搅拌回流提取2h；随后在40℃、-0.09MPa条件下旋转蒸发回收己烷，得到亚麻籽油7.05g。
3.乳液制备
将7.05g亚麻籽油与0.14g吐温-80混合后，按水油比3∶7加入30mL纯水；在冰浴条件下，以20kHz、200W功率、探头浸深1cm的超声设备处理10min，控温25℃，获得体积37mL的水包油纳米乳液。
4.乳液表征，按照实施例1中的方法测得，
平均粒径：Dn=280nm，PDI=0.35；
初始POV=2.5meq/kg;
ζ-电位=18.7mV。
5.稳定性测试
储存条件：25℃避光，密封玻璃瓶。
6个月后按照实施例1的测定方法测得，POV=2.9meq/kg。
感官变化：出现明显酸败气味，对比分析：与本发明实施例相比，常规工艺提取率降低、粒径大且不均一、稳定性差，无法满足产品质量要求。
实施例1与对比例1样品的各项数据如下表所示：
表3
从上述对比数据可以看出，本发明实施例1相较于传统工艺具有显著优势：
1.高效转化：实施例1的转酯率达到92%，而传统工艺不适用，表明本发明一次反应中油脂提取与酯交换高效完成，实现了更高的活性物质利用。
2.酶偶联优势：偶联率8.06%证明了聚合物-酶复合体中有效酶负载，提供了持续而温和的催化环境，是传统化学或物理乳化无法比拟的生物催化改性亮点。
3.超细均一粒径：实施例1的平均粒径仅85nm，PDI0.21，远优于传统工艺的280nm、PDI0.35。这种纳米级、分布窄的胶束结构有助于提高水相分散性、生物利用度及配方稳定性。
4.长期氧化稳定性：虽然两者初始POV相近，但6个月后实施例1仅升至2.3meq/kg，增幅4.5%，而传统体系升至2.9meq/kg，增幅16%。显著更好的抗氧化保持性证明了本发明中透析除杂、生育酚醋酸酯保护及自组装壳层的协同作用。
5.优良静电稳定性：实施例1的ζ-电位为-36.5mV（|ζ|≥30mV），属于高稳定范围，能有效防止颗粒团聚；传统工艺仅-18.7mV，静电屏障不足，难以长期保持均匀分散。
综上，实施例1不仅在酶催化效率和产物粒径均一性方面超越传统工艺，而且在长期储存稳定性和静电防聚集能力上也有明显优势，充分体现了“一锅式”纯水体系、高效绿色、可长效保存的技术优越性。
实施例2，该实施例提供了一种用亚麻籽制作植物水溶性欧米伽3的工艺的放大实验。
为考察本发明工艺的线性放大性，在50L反应釜中进行放大实验，其工艺步骤与实施例1相同，仅原料用量及操作规模不同，不同的步骤如下：
反应釜容积：50L；
工作体积：40L，占反应釜容积的80%。
原料与用量：聚合物-酶复合体（PEC）固形物：800g；脱壳亚麻籽粉：4000g；PBS缓冲液：35200g。
一锅式提取与酶催化
向50L反应釜中依次加入800gPEC悬液、4000g亚麻籽粉及35200gPBS缓冲液；
在40℃、300rpm条件下恒温搅拌反应4h；
温控自组装纳米乳化
以1.5℃/min速率从40℃冷却至25℃。
后处理与稳定性测试
后处理及稳定性测试步骤同实施例1，其中只有纯水以及生育酚醋酸酯用量不一致，本实施例中透析槽中纯水200L，回收乳液中加入生育酚醋酸酯39.5g。最终获得水溶性欧米伽3纳米乳液。
本实施例中转酯率、偶联率、平均粒径、PDI、POV值以及ζ-电位的测定都与实施例1中的方法相同。根据实施例1中的方法测得，转酯率为91%，偶联率为7.98%，初始POV为2.1meq/kg，六个月POV为2.2meq/kg，平均粒径为85nm，PDI=0.12，ζ-电位为-35.8mV。
放大实验结果表明，本发明工艺在50L规模下，仍能保持高转酯率、粒径均一及优良稳定性，显示出良好的工艺线性放大性和产业化前景。
实施例1、对比例1以及实施例2测得的数据汇总如下表：
表4
以上实施例以及对比例充分表明了本发明具有以下优势：
1.高效酶催化与一致性
实施例1和实施例2分别在实验室与中型规模下都实现了91-92%的转酯率与8.06%和7.98%的偶联率，证明了酶-聚合物复合体催化体系在不同量级上均保持高效一致。
2.纳米粒径与分散性
两个实施例均获得超细、分布窄的纳米粒径，平均粒径85nm，PDI0.12，远优于传统工艺。这一性能可显著提升水相分散、口感及生物利用度。
3.长期抗氧化稳定性
尽管初始POV相当，两个实施例在常温下储存6个月后的POV增幅仅为4.5-4.8%，而传统体系则达到16%，说明本发明的纳米壳层保护加抗氧剂组合能有效抑制氧化。
4.静电稳定性
两个实施例ζ-电位的绝对值都≥30mV，提供了强静电排斥作用，防止粒子团聚；传统对比例仅-18.7mV，电荷不足以维持长期分散。
5.放大可行性
放大至50L后，实施例2在所有关键指标上几乎无衰减，表明工艺具有良好的线性放大性和工业化潜力。
综上，三个例子的对比明确验证了本发明工艺在“高效转酯—酶偶联—超细自组装—长效抗氧化—优良静电稳定”方面的显著优势，并展示了从实验室到中型规模的良好一致性和可放大特性。
需要特别指出的是，本说明书及附图中列举的各项实施例，旨在阐释本发明的技术方案及其优点，而非对本发明的保护范围进行限定。在不背离本发明核心思想和技术效果的前提下，本领域技术人员可以对所述实施例的结构布置、工艺参数、材料选型、控制逻辑等进行任何形式的改进、替换、组合或变形；凡是基于同等构思而做出的显而易见的变动，均应视为本发明的同等方案，并应包含在本发明的权利要求书所界定的保护范围之内。本发明的实际保护范围以附后的权利要求书为准，并应结合说明书及附图予以正确理解。
文章摘自国家发明专利，一种用亚麻籽制作植物水溶性欧米伽3的工艺，发明人:殷鹏，付利刚，申请号:202511825627.5，申请日:2025.12.05。
