摘 要:本发明属于病原微生物检测技术领域,具体涉及一种基于RPA CRISPR/Cas12b检测水稻胡麻叶斑病菌的序列组合及应用?组合物包含的CRISPR/Cas系统包括Cas12b和sgRNA,可与特定反应体系协同使用?该快速检测方法包括以下步骤:样本预处理:对样本进行处理以提取核酸;扩增反应:利用组合物对提取的核酸进行RPA扩增反应,将核酸扩增产物用于CRISPR/Cas系统检测;结果判读:通过质控线和检测线读取并判定检测结果?本发明所提供的组合物和试剂盒,专用于检测水稻胡麻叶斑病菌?其方法操作简便,检测快速?耗时短且成本低,适用于现场快速检测?
权利要求书
1.基于RPA CRISPR/Cas12b检测水稻胡麻叶斑病菌的序列组合,其特征在于,包括RPA引物对序列?sgRNA序列和ssDNA探针序列;
所述RPA引物对是由如SEQ ID NO:1所示的正向引物和如SEQ ID NO:2所示的反向引物组成;
所述sgRNA序列如SEQ ID NO:3所示;
所述ssDNA探针序列是用于荧光PCR检测的水稻胡麻叶斑病菌的ssDNA探针序列或用于试纸条检测的水稻胡麻叶斑病菌的ssDNA探针序列;
所述荧光PCR检测的水稻胡麻叶斑病菌的ssDNA探针序列为FAM TTTTTTT BHQ1;
所述用于试纸条检测的水稻胡麻叶斑病菌的ssDNA探针序列如SEQ ID NO:4所示?
2.一种检测水稻胡麻叶斑病菌的检测试剂盒,其特征在于,包含权利要求1所述的RPA引物对序列?sgRNA序列和ssDNA探针序列?
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒,其特征在于,
所述检测试剂盒还包含缓冲液?酶干粉?MgOAC和ddH2O;所述酶干粉用于RPA反应?
4.根据权利要求3所述的检测试剂盒,其特征在于,所述检测试剂盒包括用于进行RPA扩增反应的反应体系和用于进行CRISPR/Cas12b反应的体系?
5.根据权利要求4所述的检测试剂盒,其特征在于,用于进行RPA扩增反应的反应体系的总体积为20μL,反应体系包括:正向引物?反向引物?Rehydration buffer?ddH2O和模板DNA,混匀后放入含有冻干酶粉,最后加入MgOAC;
所述用于进行CRISPR/Cas12b反应的体系的总体积为50μL;
所述CRISPR/Cas12b反应的体系包括:sgRNA?CRISPR ssDNA Reporter?AaCas12b?AaCas12b Buffer?RPA扩增产物和DEPC处理水;
或AaCas12b Buffer?sgRNA?SynSor CRISPR ssDNA Reporter?AaCas12b?RPA扩增产物和DEPC处理水?
6.权利要求2~5中任一项所述的检测试剂盒在检测田间水稻胡麻叶斑病菌种的应用?
7.一种检测水稻胡麻叶斑病菌的检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
提取待测样品中基因组DNA;
以基因组DNA为模版DNA,利用权利要求4所述的试剂盒进行RPA扩增反应,得到RPA扩增产物;
取RPA扩增产物进行CRISPR/Cas12b反应后,进行荧光检测或试纸条检测?
8.根据权利要求7所述的检测方法,其特征在于,所述RPA扩增反应条件为:39℃扩增30min;
所述CRISPR/Cas12b反应的条件为43℃反应30min,进行荧光检测;
或40℃条件下孵育25min,用DEPC处理水补足至50μL,利用试纸条进行检测?
9.权利要求7或8所述的检测方法在水稻胡麻叶斑病菌检测中的应用?
技术领域
本发明属于病原微生物检测技术领域,具体涉及一种基于RPA CRISPR/Cas12b检测水稻胡麻叶斑病菌的序列组合及应用?
背景技术
水稻胡麻叶斑病是一种由真菌引发的水稻疾病,其病原体为稻平脐蠕孢(Bipolaris oryzae),该无性型真菌是水稻胡麻叶斑病的主要致病因子,对水稻的健康和产量构成显著威胁?在水稻的生长周期中,从秧苗期直至收获期,均可观察到其病发迹象,其中叶片是最常见的受害部位,其次受害部位有谷粒?穗颈和枝梗?病原菌侵入叶鞘和茎秆时,病斑的出现会削弱植株的结构稳定性,使植株易受倒伏,影响水稻的正常生长和发育?在严重的情况下,病害可能侵入稻穗,导致穗部的病斑和腐烂,严重影响稻谷的产量和质量?谷粒早期受害的病斑灰黑色,可能扩展至全粒造成秕谷?病菌以菌丝体和分生孢子盘在病残体或种子上越冬,在适宜的条件下可以存活较长时间,成为次年病害的初侵染源,翌年3月产生分生孢子进行初侵染和再侵染?根据现有研究,水稻胡麻叶斑病对产量的影响显著,具体损失取决于病害的严重程度和田间管理水平?在中等流行年份,产量损失通常在10%~30%之间,而在严重流行年份,损失可能达到50%?发病时间对损失的影响较大,抽穗期或灌浆期的感染对产量的打击最为明显在病害流行期间,这种再侵染过程可以多次发生,导致病害迅速蔓延?病害侵染会导致稻谷品质下降,特别是千粒重降低,通常减少15%~25%?在主产区,病害造成的直接经济损失可能达到数百万美元?在适宜的环境条件下,如高温多湿的气候,病害会迅速发展,造成大面积的水稻受害?传统的检测方法包括分离培养?血清学检测和基于PCR的分子检测技术,这些方法通常存在步骤繁琐?耗时较长的缺点,且分子检测依赖于实验室设备和专业技术人员,难以满足现场快速检测的需求?因此,开发高效?便捷的快速检测技术用于稻种健康检测,对于防控水稻胡麻叶斑病的传播有重要意义?
CRISPR技术是一种基因编辑工具,利用Cas(CRISPR associated proteins)蛋白和向导RNA(sgRNA),通过特异性识别和切割外源DNA或RNA,保护细胞免受病毒感染?近年来,该技术被改造为精准?高效的基因编辑工具,开发基于CRISPR的快速检测平台,可实现病原体和生物标志物的快速灵敏检测?Cas12蛋白是一种核酸内切酶,属于CRISPR系统的II类V型家族?与Cas9相同,都属于单蛋白核酸酶,但具有不同的结构和功能特性?它最初由细菌的免疫系统中发现,主要作用是切割外源DNA以抵御病毒和外来遗传物质的入侵?Cas12可以靶向并切割DNA,靶点选择通常需要目标序列附近存在一个PAM序列,PAM序列类型通常为TTTN,N为A?C或G?基于Cas12的无差别切割活性,开发了如DETECTR的诊断平台,可检测低浓度的目标DNA或RNA,用于早期疾病诊断通过荧光信号或试纸条显示检测结果?因此,需要对CRISPR进一步研究,为快速检测水稻胡麻叶斑病菌提供一种新的方式?
发明内容
针对上述问题,本发明提供了一种基于RPA CRISPR/Cas12b检测水稻胡麻叶斑病菌的序列组合及应用,通过侧向流动试纸条建立了水稻胡麻叶斑病的可视化检测技术?
为实现上述目的,本发明的技术方案具体如下?
本发明第一方面提供了一种基于RPA CRISPR/Cas12b检测水稻胡麻叶斑病菌的序列组合及应用,包括RPA引物对序列?sgRNA序列和ssDNA探针序列;所述RPA引物对序列如SEQ ID NO:1所示的正向引物和如SEQ ID NO:2所示的反向引物组成;所述sgRNA序列如SEQ ID NO:3所示?
所述ssDNA探针序列是用于荧光PCR检测的水稻胡麻叶斑病菌的ssDNA探针序列或用于试纸条检测的水稻胡麻叶斑病菌的ssDNA探针序列;所述荧光PCR检测的水稻胡麻叶斑病菌的ssDNA探针序列为FAM TTTTTTT BHQ1?
所述荧光PCR检测的水稻胡麻叶斑病菌的ssDNA探针序列如SEQ ID NO:4所示?
本发明第二方面提供了一种检测水稻胡麻叶斑病菌的检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含所述的RPA引物对序列?sgRNA序列和ssDNA探针序列?
在另一个优选实施例中,所述Rehydration Buffer?Starter?酶干粉?MgOAC和ddH2O;所述酶干粉用于RPA反应?
在另一个优选实施例中,所述检测试剂盒包括用于于进行RPA扩增反应的反应体系和用于进行CRISPR/Cas12b反应的体系?
在另一个优选实施例中,用于进行RPA扩增反应的反应体系的总体积为20μL,反应体系包括:正向引物?反向引物?Rehydration buffer?ddH2O和模板DNA,混匀后迅速放入含有冻干酶粉的PCR反应管中,将冻干酶粉溶解后,最后加入MgOAC;所述用于进行CRISPR/Cas12b反应的体系的总体积为50μL;所述CRISPR/Cas12b反应体系包括:sgRNA?CRISPR ssDNA Reporter?AaCas12b?AaCas12b Buffer?RPA扩增产物和DEPC处理水;或者AaCas12b Buffer?sgRNA?SynSor CRISPR ssDNA Reporter?AaCas12b?RPA扩增产物和DEPC处理水?
本发明第三方面提供了检测试剂盒在检测田间水稻胡麻叶斑病菌种的应用?
本发明第四方面提供了一种检测水稻胡麻叶斑病菌的检测方法,包括以下步骤:CTAB法提取待测样品中基因组DNA;以基因组DNA为模版DNA,利用所述的试剂盒进行RPA扩增反应,得到RPA扩增产物;利用所述的检测试剂盒,取RPA扩增产物进行CRISPR/Cas12b荧光检测法或试纸条检测?
在另一个优选实施例中,所述RPA扩增反应的反应体积包括:正向引物?反向引物?Rehydration buffer?ddH2O和模板DNA,混匀后迅速放入含有冻干酶粉的PCR反应管中,将冻干酶粉溶解后,最后加入MgOAC,离心,RPA扩增反应条件为:39℃扩增30min;所述CRISPR/Cas12b反应的体系包括:sgRNA?CRISPR ssDNA Reporter?AaCas12b?AaCas12b Buffer?RPA扩增产物和DEPC处理水,所述CRISPR/Cas12b反应的条件为:43℃反应30min,进行荧光检测,其中荧光检测采用的仪器为WL 16型便携式等温检测仪;Reporter?AaCas12b?RPA扩增产物和DEPC处理水,所述CRISPR/Cas12b反应的条件为:40℃条件下孵育25min,用DEPC处理水补足至50μL,利用试纸条进行检测?
本发明第五方面提供了所述的检测方法在水稻胡麻叶斑病菌检测中的应用?
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果?
本发明通过利用RPA CRISPR/Cas12b技术,得到了一组用于检测水稻胡麻叶斑病菌的序列组合,其检测灵敏度高,可检测低至飞克级病原浓度,通过多重引物设计,特异性强,能精准识别真菌目标序列,降低假阳性风险?无需复杂设备,反应时间短,适合现场快速检测?结合荧光信号或试纸条直接读取结果,便捷高效?
本发明提供的方法能够快速且准确地诊断水稻是否受到胡麻叶斑病菌的感染,有助于有效防治水稻胡麻叶斑病,降低经济损失?
附图说明
图1为RPA体系优化琼脂糖凝胶电泳结果图,(a)为反应温度的结果图,(b)为反应时间的结果图?
图1
图2为特异性sgRNA的筛选;设计三条sgRNA分别与靶标菌B.oryzae和同属非靶标菌B.maydis进行荧光实验的结果图?其中,B.oryzae表示稻平脐蠕孢,B.maydis表示玉蜀黍平脐蠕孢菌?
图2
图3为RPA CRISPR/Cas12b荧光体系优化结果图;(a)为不同浓度sgRNA对荧光强度的影响,图中,1~7分别表示sgRNA的浓度为0μg/µL(使用ddH2O代替)?6μg/µL?5μg/µL?4μg/µL?3μg/µL?2μg/µL?1μg/µL;(b)为不同浓度Cas12b对荧光强度的影响结果图;图中1~6分别表示Cas12b的浓度为0.02μmol/L?0.04μmol/L?0.06μmol/L?0.08μmol/L?0.1μmol/L?0μg/µL(使用ddH2O代替);(c)不同浓度的报告分子对荧光强度的影响结果图,图中1~6分别表示的浓度为1μmol/L?0.8μmol/L?0.6μmol/L?0.4μmol/L?0.2μmol/L?0μg/µL(使用ddH2O代替)?
图3
图4为RPA CRISPR/Cas12b特异性检测结果图;(a)为RPA测试引物特异性电泳结果;(b)为RPA/CRISPR Cas12b荧光检测;(c)为RPA/CRISPR Cas12b试纸条检测;T表示检测线,C表示质控线?图中,1为稻平脐蠕孢,2为麦根腐平脐蠕孢,3为玉蜀黍平脐蠕孢,4为稻绿核菌,5为禾谷镰刀菌,6为立枯丝核菌,7为串珠镰刀菌,8为稻梨孢菌,9为新月弯孢菌,10为ddH2O作为阴性对照?
图4
图5为RPA CRISPR/Cas12b灵敏度检测结果图?(a)为PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果;(b)为RPA/CRISPR Cas12b荧光检测;(c)为RPA/CRISPR Cas12b试纸检测方法;T表示检测线,C表示质控线;1~5表示BO DNA的稀释液浓度依次为430ng?43ng?4.3ng?0.43ng?43pg;6表示ddH2O作为阴性对照?
图5
图6为实际样品检测结果图;(a)为1~4来源崖州中国农业科学院作物科学研究所海南试验站,5~8来源陵水国家农业科技园区,9~12来源三亚吉阳区吉阳镇南亚幼儿园东北侧农田区;(b)1?2?5?6?9?10为患胡麻叶斑病叶片,3?4?7?8?11?12为患病植株正常叶片, 为阴性对照?
图6
具体实施方式
以下将结合附图对本发明作更详细的说明,附图中展示了本发明的部分实施例,但并非其全部形式?实际上本发明可通过多种方式实现,因此不应局限于本文所述的具体实施方案?本文提供的定义和方法旨在明确本发明的范围,并为本领域普通技术人员提供实施指导?基于本文内容及附图信息,本领域技术人员可以对本发明进行各种修改或提出其他实现方式?因此,本发明不限于所公开的特定实施例,所有基于本发明内容的修改及其他实现方式均包含在附加权利要求的保护范围内?
本发明所涉及的所有术语均应可按照本领域普通技术人员的通常理解进行解释?为更全面地阐明本发明的内容,以下提供的定义将起到补充和指导作用?本发明不局限于公开的具体实施例,对于实施例中未明确说明的技术或条件,可参考本领域相关文献所述的技术或条件,或依据产品说明书进行操作?
实施例1
特异性基因的靶标保守性分析和引物设计
在NCBI网站检索水稻胡麻叶斑病菌的特异性基因,经同源性分析和BLAST比对,选取稻平脐蠕孢与其同属病原菌之间具有显著差异的区域进行特异性设计引物,包括RPA引物RPA BoAra43A F/R,以及CRISPR Cas12b系统所用的1uL的sgRNA?所有sgRNA均由讯识生物有限公司合成?
AaCas12b的sgRNA(single guide RNA)识别邻近5' TTN 3'位点的20nt靶序列?利用CRISPR DT Cpf1在线软件设计sgRNA识别位于BO特异性RPA引物对之间的扩增子区域,利用该软件计算每个sgRNA的效率,选择效率较高的sgRNA进行检测,随后将sgRNA用于CRISPR/Cas12b检测,具体如图2所示?
用于WL 16型便携式等温检测仪检测ssDNA探针序列,能够与水稻胡麻叶斑病菌的靶标序列特异性结合,通过PCR扩增产生的荧光信号实现目标病菌的高灵敏度检测?荧光PCR检测的水稻胡麻叶斑病菌的ssDNA探针序列为FAM TTTTTTT BHQ1?
用于侧向层析试纸条检测的ssDNA探针序列:专为免疫层析试纸条设计,通过靶标序列与试纸条上的结合位点特异性作用,在检测线上显示结果,适合于水稻胡麻叶斑病菌的快速筛查和野外检测需求?用于试纸条检测的水稻胡麻叶斑病菌的ssDNA探针序列如SEQ ID NO:4所示:5’ TTTTTAATTTTT 3’?在SEQ ID NO:4的5’链接FAM探针,在3’链接有Biotin探针?
选择设计的PCR及RPA特异性引物,sgRNA的序列如SEQ ID NO:3所示:GUCUAAAGGACAGAUUUUCAACGGGUGUGCCAAUGGCCACUUUCCAGGUGGCAAAGCCCGUUGAACUU CAAGCGAAGUGGCACCGGUUGCGGUGGAGAGUUUG?
RPA引物对序列如SEQ ID NO:1所示的正向引物和如SEQ ID NO:2所示的反向引物组成?
SEQ ID NO:1:TGGCATCGACAAATTCACCGGCACCTCACTC?
SEQ ID NO:2:AGTGCTGTACCAAAACGTCGCCTGGCGCAG?
实施例2 RPA扩增反应及sgRNA的筛选
1?供试菌株的选择,供试菌株包括9株水稻真菌性病菌,具体种类如下:
靶标菌株:稻平脐蠕孢(Bipolaris oryzae)由中国农业大学彭友良教授团队馈赠;同属非靶标菌株:玉蜀黍平脐蠕孢(Bipolaris maydis)由中国农业大学朱旺升教授团队馈赠,麦根腐平脐蠕孢(Bipolaris sorokinianaShoemaker)由河北农业大学王逍冬教授团队馈赠;常见水稻病原真菌:立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn)?稻梨孢菌(Pyricularia oryzae)?禾谷镰刀菌(F.graminearum)?串珠镰刀菌(Fusarium moniliform)由中国农业大学彭友良教授课题组惠赠,新月弯孢菌(Curvularia lunata)由中国农科院资源区划所邓晖惠赠,稻绿核菌(Ustilaginoidea virens(Cke,)Tak.)由中国农业大学孙文献教授课题组分离并保存?
2?DNA提取:采用CTAB法提取各菌株的基因组DNA?
2.1?RPA恒温扩增
RPA扩增反应体系为:1µL浓度为10µM的正向引物?1µL浓度为10µM的反向引物?10µL 2×Rehydration buffer?4µL ddH2O?2µL模板DNA?
将上述组分混匀后,迅速加入含有冻干酶粉的PCR反应管中,待冻干酶粉溶解后,最后加入2µL的MgOAc?混匀后放入金属浴中,设置温度40℃,孵育30min,随后加入30μL的体积比为24:1的氯仿和异戊醇的混合液提取反应液,并以12000r/min离心5分钟?取5μL上清液进行电泳分析,每个反应重复三次
结果观察:通过琼脂糖凝胶电泳观察是否有扩增的目标条带,只有含水稻胡麻叶斑病菌的RPA扩增产物出现目标条带,目标产物是483bp,其他无条带,说明该RPA体系不仅特异性强,如图4中的a所示?
3?特异性sgRNA序列的筛选
根据GenBank中Bipolaris oryzae的BoAra43A序列设计sgRNA:
通过RPA反应扩增含PAM序列的靶标序列,扩增产物通过CRISPR/Cas12b反应?50μL的反应体系为:5μL 10×AaCas12b Buffer?1μL sgRNA?0.5μL CRISPR ssDNA Reporter(12b FAM)?2μL AaCas12b(2.5µM)?1μL RPA扩增产物和40.5μLDEPC处理水;于WL 16型便携式等温检测仪上进行反应,43℃每分钟收集一次FAM荧光信号,时间30分钟?实验重复三次?
实施例3 RPA CRISPR/Cas12b检测体系
1?RPA CRISPR/Cas12b荧光检测方法的特异性和灵敏度测试
以1株水稻胡麻叶斑病菌?2株同属非靶标菌株及6株常见水稻病原真菌的DNA为模板进行特异性测试?通过实验结果判断所建立的水稻胡麻叶斑病菌检测方法的特异性?
以水稻胡麻叶斑病菌提取的DNA为样本,制备10倍梯度稀释液,并将其作为模板进行灵敏度测试?通过逐级稀释的模板反应结果,评估检测方法的最低检测限,明确该方法对低浓度目标DNA的识别能力?此外,将测试结果与普通RPA及荧光PCR检测方法进行对比,分析三种方法在灵敏度上的差异,以验证所建立方法的可靠性和优势?
2?RPA CRISPR/Cas12b试纸条检测方法的特异性和灵敏度测试
用于进行RPA/Cas12b LFA为50μL反应体系包括:5μL 10×AaCas12b Buffer?1μL sgRNA?0.2μL SynSor CRISPR ssDNA Reporter?2μL AaCas12b(2.5µM)?1μL RPA扩增产物和40.8μL DEPC处理水;CRISPR反应时间为25min?
取CRISPR反应后的产物50µL,滴加至试纸条的样本垫上,滴加位置不超过MAX线;常温下放置5min,待液面超过C线和T线后,分析结果?
3?结果
3.1 RPA体系的优化
为优化RPA反应温度,分别设置了37℃?38℃?39℃?40℃?41℃的反应条件,选择40℃作为后续实验中的最佳扩增温度如图1中的a所示;为优化RPA反应时间,试验分别设置了15min?20min?25min?30min?35min的扩增时间,为确保检测的快速性和高灵敏度,选择了30min作为后续实验中的最佳扩增时间,如图1中的b所示?
3.2 RPA CRISPR/Cas12b荧光体系优化
sgRNA浓度为2μg/µL时荧光信号最明显,如图3中的a所述,当Cas12b浓度为0.06μmol/L时,荧光信号最强,而ddH2 O无荧光信号产生,如图3中的b所示,选择浓度为0.06μmol/L的Cas12b和浓度为2μg/µL的sgRNA作为后续实验的优化条件?荧光信号随报告分子ssDNA Reporter浓度的增加而增强如图3中的c所示,考虑到成本和灵敏度的平衡,最终选择报告分子终浓度为0.6μmol/L作为最佳浓度?
3.3特异性测试
用CRISPR Cas12b荧光法对扩增产物进行检测,结果如图4中的b所示,稻平脐蠕孢DNA样品产生了明显的荧光信号,而其他真菌DNA样品及水(空白对照)没有产生明显的荧光信号?使用CRISPR Cas12b试纸条法进行检测,只有水稻胡麻叶斑病菌出现阳性检测条带,其余近似种和水稻上其他病原菌均无检测条带,表明该方法有较强的特异性?
3.4灵敏度测试
当DNA浓度为0.43ng/µL时,在琼脂糖凝胶电泳下出现条带,如图5中的a所示?用CRISPR Cas12b荧光法进行检测,CRISPR Cas12b荧光法的检测灵敏度为0.43ng/µL,如图5中的b所示,使用优化后的RPA/CRISPR Cas12b试纸条方法检测相同梯度稀释的稻平脐蠕孢基因组DNA,CRISPR Cas12b试纸条的检测灵敏度同样为0.43ng/µL,如图5中的C所示,与CRISPR Cas12b荧光法的灵敏度一致?
3.5实际样品检测
从海南三亚崖州区?陵水?吉阳区三个地点采样,选择水稻胡麻叶斑病自然病株,在病株中选择已经出现水稻胡麻叶斑病症状和未出现症状的水稻叶片各两片,每个地点随机采6株,如图6中的a?
试纸条检测崖州区?陵水样品均为阳性,ddH2O试纸条检测为阴性,表明病株未出现症状的水稻叶片中已经受到该病的侵染,吉阳区发病样品检测为阳性,未发病样品和ddH2O试纸条检测为阴性,如图6中的b所示?
最后,需要注意的是,以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述,并非对本发明的范围进行限定,凡根据本发明精神实质所作的等效修改或修饰,都应涵盖在本发明的保护范围内?
文章摘自国家发明专利，基于RPA-CRISPR/Cas12b检测水稻胡麻叶斑病菌的序列组合及应用，发明人：汪激扬,孙文献,郭凤,刘华容,崔福浩,吕世民,张莅瑄,邱昶玮,申请号：202510700762.0，申请日：2025.05.28
