摘 要：目的：初步研究聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）法鉴别复方罗布麻颗粒中罗布麻源性成分的可行性。方法：在前期建立的PCR-RFLP鉴别体系基础上，利用SnapGene软件预测罗布麻（Apocynum venetum L.）、白麻（Apocynum pictum Schrenk）、菊花（Chrysanthemum morifolium Ramat.）和山楂（Crataegus pinnatifida Bunge）psbA-trnH扩增片段长度及Ssp I酶切位点，并进行试验验证。针对复方制剂基质复杂、目标DNA含量较低且可能发生降解的特点，采用磁珠法提取富集DNA，并结合Touchdown PCR优化扩增条件。对A药厂221003批次同一大包装内的3袋独立小包装样品分别进行全流程检测，以考察检测结果的一致性；同时检测B药厂260401批次样品，以初步考察其在不同生产企业样品中的应用可行性。通过制备模拟清膏及开展梯度热浸试验，考察加工过程对目标DNA可扩增性的影响。结果：序列分析预测罗布麻理论扩增片段长度为336bp，经Ssp I酶切后产生228bp和108bp片段；白麻和山楂不含该酶切位点，菊花理论酶切片段长度为300bp和210bp。试验所得扩增及酶切条带的数量和迁移位置与理论预测结果相符。221003批次3袋独立小包装样品均获得一致且可清晰判读的罗布麻特征性酶切图谱，260401批次样品亦获得与罗布麻叶特征性酶切图谱相符的结果。随着热浸时间延长，目标DNA 特异性扩增条带逐渐减弱，但热浸3h后仍可获得特异性扩增产物；3份独立制备的清膏样品均未检出目标特异性扩增条带。结论：本研究将前期建立的PCR-RFLP鉴别体系拓展并优化用于复方罗布麻颗粒，在所考察的2家生产企业2批样品中均获得可清晰判读的罗布麻特征性酶切图谱，表明该方法在所考察样品中具有应用可行性。由序列分析与理论图谱预测、试验验证及复杂基质条件优化组成的技术路线，可为类似复方中药制剂中源性成分分子生物学鉴别方法的开发提供参考。
关键词：罗布麻；复方中药制剂；聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性；分子生物学鉴别
罗布麻（Apocynum venetum L.）为夹竹桃科植物，其干燥叶具有平肝安神、清热利水的功效[1-2]，系《中华人民共和国药典》（简称《中国药典》）2025年版一部收载的中药材[3]，临床常用于治疗眩晕、心悸、失眠及水肿等[4-5]。根据国家药品监督管理局公开数据统计，截至2025年3月，含罗布麻叶的中药品种共计56种，涵盖颗粒、片剂、胶囊等多种剂型，其中复方罗布麻颗粒为临床常用制剂之一。
罗布麻叶与混淆品白麻叶（Apocynum pictum Schrenk）在药材性状上极为相似，但其化学成分、药效及毒理学特性显著不同[6-8]。前期市场调研显示，市售标示为“罗布麻叶”的药材中，约有67%实际为未被《中国药典》收载的白麻叶[9]。由于白麻叶的药效与安全性尚未得到全面评价，其在复方制剂中如果被混用或代用，可能严重影响制剂的质量稳定性与用药安全性。因此，亟须针对复方中药制剂建立专属性强、准确度高的源性成分鉴别方法。
传统的中药鉴别方法主要依赖性状观察、显微分析及理化检测等手段。然而，中药制剂的药材原料经过粉碎等加工，导致其原有的形态学特征基本消失，传统方法的应用受到一定限制。近年来，基于DNA序列的分子生物学鉴别技术凭借其不依赖表型特征、特异性强等优势，在中药材真伪鉴别中得到逐步应用[10-11]，如DNA条形码技术[12]、特异性聚合酶链式反应（PCR）[13]及聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）[14]等。PCR-RFLP是一种基于PCR扩增和限制性内切酶酶切的分子分型技术，常用于检测目标DNA序列中的多态性或特定位点突变[15]。该方法广泛应用于物种鉴定[16-17]和基因分型[18]等领域。
本课题组前期基于叶绿体psbA-trnH间隔区序列，已成功构建可稳定区分罗布麻叶与白麻叶的PCR-RFLP鉴别体系，并验证了其在单味药材鉴别中的可行性[9]。但中药材经煎煮、浓缩、干燥等加工后，DNA可能发生断裂和降解，导致目标片段完整性下降、可扩增模板减少，并影响后续PCR扩增[19]。且制剂中复杂的辅料背景及多味药材组分的复杂性，也给此方法在鉴别复方罗布麻颗粒中的罗布麻源性成分带来了不确定性[20]。基于此，本研究拟采用前期构建的PCR-RFLP鉴别体系，初步评估该方法在复方罗布麻颗粒中鉴别罗布麻源性成分的可行性。
1 材料
1.1 样品
本研究所用中药材包括罗布麻叶（Apocynum venetum L.）、白麻叶（Apocynum pictum Schrenk）、菊花（Chrysanthemum morifolium Ramat.）及山楂（Crataegus pinnatifida Bunge）。其中，罗布麻叶与白麻叶为实验室保存样品，由本单位支荣荣主任中药师鉴定；菊花与山楂购自当地药店，由本单位丁爱华副主任中药师鉴定。复方罗布麻颗粒购自市场（A药厂，批号：221003；B药厂，批号：260401）。根据药品说明书，复方罗布麻颗粒的处方由罗布麻、菊花、山楂及辅料组成。
1.2 试剂和仪器
磁珠法植物DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司，批号：A0704A），GeneRed核酸染料（天根生化科技有限公司，批号：A1028A01），DNA MarkerI（天根生化科技有限公司，批号：W0116），Ex Taq DNA聚合酶（Hot Start Version，包含10×PCR buffer和dNTP Mixture，TaKaRa公司，批号：A072674A），限制性内切酶Ssp I（TaKaRa公司，批号：AN8221A），TaKaRa MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit（TaKaRa公司，批号：AN71698A），磁珠法微量DNA胶回收试剂盒[生工生物工程（上海）股份有限公司，批号：K828KA5780]，ddH2O[生工生物工程（上海）股份有限公司，批号：KA26KA6477]。
SimpliAmp Thermal Cycler PCR仪（Thermo Fisher Scientific公司），Fresco21离心机（Thermo Fisher Scientific公司），Precision GP 10水浴锅（Thermo Fisher Scientific公司），4600SF全自动化学发光图像分析系统（上海天能科技有限公司），Tanon EPS 300电泳仪（上海天能科技有限公司），One Drop OD-1000+超微量分光光度计（南京五义科技有限公司），MPE系列高通量真空平行浓缩仪（RayKol公司）。
2 方法
2.1 psbA-trnH序列分析
在前期研究中，已完成罗布麻与白麻的psbA trnH区段测序与序列比对，结果表明罗布麻在228bp处存在特异性Ssp I酶切位点，而白麻则无该位点，且该位点在罗布麻属内具有较高的种间特异性和种内保守性[9]。本研究在此基础上，以该酶切位点为特异性识别标志，进一步拓展至复方罗布麻颗粒中罗布麻源性成分的分子生物学鉴别应用。关键问题在于验证是否能够将罗布麻与制剂中其他源性成分（菊花和山楂）的PCR-RFLP片段区分开来。
在进行试验以前，先评估方法的理论可行性，利用SnapGene软件对从GenBank下载的菊花（ON534029.1）、山楂（PQ346301.1）及课题组前期测序并确认的罗布麻与白麻序列进行比对分析，定位扩增区域，并预测各药材在Ssp I（识别序列5’-AAT/ATT-3’）作用下的酶切位点及片段长度。
叶绿体非编码区psbA-trnH序列作为鉴定条形码，引物序列参照《中国药典》2025年版四部9107中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则[21]，序列扩增正向引物为psbAF(5’-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3’)，反向引物为trnHR(5’-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3’)。
2.2 模板DNA提取
中药原药材（罗布麻叶、白麻叶、菊花和山楂）经液氮研磨粉碎后，采用TaKaRa MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit（基于离心柱法）提取基因组DNA。复方罗布麻颗粒、模拟加工后中国药事2026年8月第40卷第8期953CHINESE PHARMACEUTICAL AFFAIRS zhgysh的清膏以及热浸处理后的中药材，考虑到其生产过程中由于煎煮、浓缩等工艺可能导致DNA降解，采用磁珠法植物DNA提取试剂盒进行提取，通过磁珠对DNA的高效吸附与富集，以获得足量的模板DNA。
2.3 PCR扩增
PCR扩增在25μL反应体系中进行，包含10×PCR buffer 2.5 μL，上、下游引物（均 2.5 μmol·L-1）各 1.0 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol·L-1）1.0 μL，Ex Taq聚合酶（5U·μL-1）0.5μL，模板DNA 2.0μL，ddH2O补足余量。使用ddH2O代替模板DNA作为空白对照。
前期研究表明，该引物的适宜退火温度为56℃。预试验中，复方罗布麻颗粒DNA采用常规PCR程序扩增时，在100～200bp范围内出现非特异性条带。为提高扩增特异性，采用 Touchdown PCR 程序：95℃预变性5min；随后进行10个Touchdown循环：95℃30s，退火30s（首循环65℃，每循环降低1℃，至56℃），72℃1min；再进行30个循环：95℃30s，56℃30s，72℃1min；最后72℃延伸10min。
2.4 限制性酶切反应
取PCR扩增产物进行Ssp I限制性内切酶消化反应。酶切反应体系（20μL）包含：PCR扩增产物10.0μL，Ssp I内切酶1.0μL，10×Ssp I缓冲液2.0μL，余量以灭菌ddH2O补足。置于37.0℃恒温水浴中酶切1.5h。
2.5 扩增产物分析
PCR产物与酶切产物分别按比例加入10×上样缓冲液，进行琼脂糖凝胶（1.3%，含Gene Red核酸染料）电泳。PCR产物和酶切产物上样体积分别为5μL、10μL，在120V条件下电泳约40min。电泳后利用图像分析系统观察条带分布。对罗布麻叶、菊花和山楂的PCR扩增主条带分别进行胶回收和双向测序，并将所得序列与相应物种的psbAtrnH参考序列进行比对，以验证扩增产物的物种来源。
2.6 市售复方罗布麻颗粒的PCR-RFLP检测与测序验证
试验对象为A药厂生产的221003批次和B药厂生产的260401批次。对于221003批次，从同一大包装中随机选取3袋独立小包装样品，分别取样
并独立完成DNA提取、PCR扩增、Ssp I酶切及琼脂糖凝胶电泳分析，以考察同一批号样品全流程检测的一致性；对260401批次样品进行DNA提取和PCR-RFLP检测，以初步考察该方法在不同生产企业市售样品中的应用可行性。以各样品能否获得与罗布麻叶特征性酶切图谱在条带数量和迁移位置上相符且可清晰判读的结果作为评价依据。
对221003批次3份样品的PCR扩增主条带分别进行胶回收和双向测序，并将所得序列与罗布麻psbA-trnH参考序列进行比对，以验证扩增产物的物种来源。
2.7 模拟清膏样品的制备与检测
为考察制剂加工过程对DNA完整性的影响，参照WS3-B-1189-92-3复方罗布麻颗粒国家药品标准的生产工艺，制备模拟制剂。称取罗布麻叶110g，菊花和山楂各55g，加灭菌蒸馏水，山楂煎煮4h，罗布麻与菊花在90℃条件下热浸3h，得到煎液，分别过滤得到滤液，合并滤液，然后经高通量真空平行浓缩仪减压浓缩制备成清膏。按上述方法独立制备3份模拟清膏，分别提取DNA并进行PCR扩增检测。
2.8 热浸处理对PCR扩增的影响
为考察热浸处理及过滤过程对目标DNA片段检测的影响，将罗布麻叶和白麻叶分别置于90℃热水中浸泡1、2和3h。各时间点热浸结束后进行过滤，分别收集处理后的药材固体；另收集热浸3h后的未经浓缩滤液100μL。以上药材固体和滤液分别提取DNA并进行PCR扩增检测。
3 结果与分析
3.1 序列分析
各药材在psbA-trnH序列中的Ssp I酶切位点及酶切后的片段长度见表1。从表1可以看出，罗布麻叶的预测酶切片段大小与白麻叶、菊花和山楂显著不同。因此，该PCR-RFLP方法在理论上能够有效区分复方罗布麻颗粒中的罗布麻源性成分。
表1 不同药材psbA-trnH扩增产物长度及Ssp I酶切位点预测结果
3.2 PCR结果分析
对罗布麻叶、菊花、山楂及复方罗布麻颗粒的DNA进行了psbA-trnH序列扩增，结果见图1。罗布麻叶、菊花和山楂均可扩增出清晰的主条带，其迁移位置分别位于300～400bp、500～600bp和300～400bp。根据引物在参考序列上的结合位置，利用SnapGene软件推算的理论扩增片段长度分别为336、510和398bp，凝胶电泳条带的迁移位置与理论扩增片段长度一致。罗布麻叶、菊花和山楂PCR扩增主条带的双向测序结果分别与相应物种的psbA-trnH参考序列一致。
复方罗布麻颗粒的电泳结果显示，可见一条清晰的主条带，其迁移位置与罗布麻叶扩增产物相近；同时可见一条较弱条带，其迁移位置与菊花扩增产物相近。上述结果提示，复方罗布麻颗粒中可能扩增获得来源于罗布麻叶和菊花的相应DNA片段。然而，仅依据琼脂糖凝胶电泳条带的迁移位置，尚不能准确判定扩增片段的来源，也难以排除白麻等近缘物种产生相近长度扩增产物的干扰。因此，本研究进一步采用限制性片段长度多态性（RFLP）酶切分析，对扩增产物的物种来源进行鉴别。
图1 复方罗布麻颗粒及其源性药材DNA的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图
3.3 RFLP结果分析
为验证不同药材PCR扩增产物的限制性酶切特征，对罗布麻叶、菊花、山楂和白麻叶的psbA trnH扩增产物进行Ssp I酶切分析，结果见图2。
罗布麻叶PCR扩增产物经Ssp I酶切后，原有主条带消失，出现2条迁移位置分别位于200～300bp和约100bp的特征性条带，与SnapGene软件预测的228 bp 和108bp酶切片段相符。白麻叶PCR扩增产物在酶切前后均呈现1条位于300～400bp的主条带，未观察到明显的酶切片段，其电泳结果与中国药事2026年8月第40卷第8期955CHINESE PHARMACEUTICAL AFFAIRS zhgysh理论预测的314bp扩增片段不含Ssp I识别位点相符。
菊花PCR扩增产物经Ssp I 酶切后出现2条特征性条带，其迁移位置与理论预测的300bp和210bp酶切片段相符；山楂PCR扩增产物在酶切前后均呈现1条位于300～400bp范围内的主条带，未观察到明显酶切。总体而言，各药材PCR扩增产物及其酶切产物的条带数量和迁移位置与SnapGene序列分析的理论预测结果一致。
图2 罗布麻叶菊花、山楂和白麻叶的PCR扩增产物及其Ssp I酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图
3.4 PCR-RFLP检测结果
对A药厂221003批次同一大包装内的3袋独立小包装样品分别取样，并独立完成DNA提取、PCR扩增、Ssp I酶切及琼脂糖凝胶电泳分析，结果见图3（T1～T3）。3份样品均获得一致且可清晰判读的罗布麻特征性酶切图谱，表明该批样品的全流程检测结果具有较好的一致性。3份样品PCR扩增主条带的测序结果均与罗布麻psbA-trnH序列一致，进一步确认了扩增产物的物种来源。
对B药厂260401批次样品进行检测，结果见图3（T4）。该样品同样获得了与罗布麻叶特征性酶切图谱相符的结果。上述结果初步表明，该方法可用于本研究所考察的不同生产企业复方罗布麻颗粒中罗布麻源性成分的鉴别。
图3 复方罗布麻颗粒 DNA 的 PCR 扩增产物及其 Ssp I 酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图
3.5 模拟加工过程中目标DNA可扩增性的变化
为考察加工过程对目标DNA可扩增性的影响，对热浸处理后的药材、热浸液及过滤浓缩后的清膏样品进行了PCR检测。3次独立制备的清膏样品在本研究的DNA提取及PCR条件下均未检出目标特异性扩增条带，而相应原料药材均可正常扩增。热浸处理1～3h后的药材固体均可获得目标扩增条带，且条带随热浸时间延长呈逐渐减弱趋势，见图4。在本研究的取样量和提取条件下，热浸3h后的液体样品未检出目标特异性扩增条带。
图4 热浸处理的罗布麻叶和白麻叶的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图
4 方法
4.1 方法建立阶段的测序验证
在本研究的方法建立与验证阶段，对罗布麻叶、菊花和山楂药材的PCR扩增产物进行了双向测序，所得序列分别与相应物种的psbA-trnH参考序列一致，验证了各药材扩增产物的物种来源。在此基础上，进一步对221003批次3份独立小包装样品的PCR主条带进行了双向测序，所得序列均与罗布麻psbA-trnH参考序列一致，支持PCRRFLP特征性酶切图谱的判读结果。测序在本研究中作为扩增产物来源的辅助确认手段。
4.2 PCR-RFLP 检测条件的优化
针对复方罗布麻颗粒基质复杂、目标DNA含量较低且可能发生降解的特点，本研究对DNA提取和PCR扩增条件进行了优化。为提高获得可扩增模板的可能性，采用磁珠法对样品DNA进行提取和富集。预试验中，常规PCR扩增在100～200bp出现非特异性条带，因此引入Touchdown PCR技术[22]，通过逐步降低退火温度改善引物结合的特异性，减少非特异性扩增。经优化后，复方罗布麻颗粒可获得条带清晰、便于判读的PCR扩增及酶切图谱。上述优化为复杂中药制剂中目标DNA片段的扩增和PCR-RFLP图谱判读提供了试验基础。
4.3 制剂工艺对 DNA 检测的影响
本研究对模拟加工过程中不同阶段的样品进行了检测。热浸处理1～3h后的罗布麻叶和白麻叶固体样品均可获得目标扩增条带，但条带随热浸时间延长逐渐减弱，提示持续热处理可能降低目标DNA的可扩增性。在本研究的取样量、DNA提取方法及PCR条件下，热浸3h后的液体样品，以及经过滤、浓缩制得的清膏样品均未检出目标特异性扩增条带。3次独立制备的清膏样品检测结果一致，而相应原料药材均可正常扩增。
清膏样品未检出目标条带并不代表其中完全不存在罗布麻来源DNA，可能与热浸、过滤后进入液相的目标DNA含量较低，以及浓缩后复杂基质对DNA提取和PCR扩增的影响有关。上述结果提示，热浸、过滤和浓缩等加工环节可能共同影响目标DNA的保留与检出。
与模拟清膏不同，市售复方罗布麻颗粒可获中国药事2026年8月第40卷第8期957CHINESE PHARMACEUTICAL AFFAIRS zhgysh得清晰的罗布麻特征性扩增及酶切图谱，且扩增产物经测序确认为罗布麻psbA-trnH序列。该差异可能与实验室模拟工艺和实际生产工艺在过滤、浓缩、制粒及固形物保留等方面的差异有关。
4.4 分子生物学鉴别方法的应用与展望
本研究在中药制剂分子生物学研究中系统引入了“序列分析-图谱预测-试验验证”的方法开发流程。通过NCBI公共数据库下载目标物种的叶绿体基因组序列，开展psbA-trnH序列扩增区比对和Ssp I酶切位点预测，构建各源性成分的理论图谱，再通过试验进行验证，体现了方法设计的科学性与逻辑闭环。这一流程有助于提升方法开发效率，避免盲目试验，为中药制剂分子生物学鉴别方法的建立提供参考。
在现行中药质量标准体系中，性状、显微及理化检测仍是基础手段。然而，由于原料来源复杂且经过加工，传统方法存在一定局限性。基于DNA序列的分子生物学方法可作为传统鉴别手段的重要补充，尤其在复杂中药制剂中表现出一定的优势。未来，可以进一步探索针对更小片段的Mini-Barcoding技术，以应对DNA降解更为彻底的极端样本[23]。这为未来中药鉴别方法的拓展提供了新的思路和实践方向。
综上，该PCR-RFLP方法在本研究所考察的2家生产企业2批次复方罗布麻颗粒中均获得可清晰判读的罗布麻特征性酶切图谱，表明其在所考察的样品中具有初步应用可行性。本研究结论仅限于所考察样品范围，其更广泛的适用范围可结合更多市售样品进一步评价。
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