摘 要：本发明涉及农作物遗传育种技术领域，尤其涉及一种高CBD工业大麻的快速选育方法。本发明提供了一种高CBD工业大麻的快速选育方法，该方法通过高纯度亲本选配与正反交构建高分离潜力的F1代基础群体，采用橄榄酸联合茉莉酸甲酯构建有效成分合成定向代谢胁迫筛选体系；仅在F1代完成1次离体定向筛选锁定核心目标基因型；然后连续回交聚合了轮回父本的优良性状最终选育的品系具有高CBD含量；而且后续回交世代采用温室短日照加代结合活体快速无损检测技术完成连续回交，无需重复组培操作，最终经自交纯化获得性状稳定的目标品系。
权利要求书
1.一种高CBD工业大麻的快速选育方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）选择THC含量≤0.2%、CBD含量≥1%作为母本，THC含量≤0.15%、CBD含量≥3%作为父本；
（2）将父本和母本进行正交和反交，得到正交F1代种子和反交F1代种子，混合构建F1代基础分离群体；
（3）选择F1代种子无菌萌发后的幼嫩外植体接入初代定向筛选分化培养基进行初代培养，得到不定芽；将不定芽转入继代定向筛选培养基中进行继代培养，得到复筛不定芽；
（4）将复筛不定芽接入生根培养基中进行生根培养，得到候选株系；
（5）将候选株系移栽至大田后检测其THC和CBD含量，将THC含量≤0.2%、CBD含量≥4.5%、CBD/THC比值≥20:1的单株作为轮回亲本；
（6）以轮回亲本为轮回母本、步骤（1）的父本作为轮回父本进行连续回交，直至获得BC3F1代群体；
（7）将BC3F1代群体进行连续两代自交纯化，得到高CBD工业大麻。
2.根据权利要求1所述的快速选育方法，其特征在于，步骤（3）中，所述无菌萌发的步骤为：将F1代种子进行消毒后，接入1/2MS固体培养基中，在20～30℃、12h光照/12h黑暗条件下培养至萌发。
3.根据权利要求2所述的快速选育方法，其特征在于，所述消毒的方法为：将F1代种子经70～80%乙醇消毒25～35s，无菌水冲洗2～4次，再经1～3%次氯酸钠溶液消毒8～12min，无菌水冲洗4～6次。
4.根据权利要求1所述的快速选育方法，其特征在于，步骤（3）中，所述初代定向筛选分化培养基为：MS培养基+6-苄基腺嘌呤1.0～2.0mg/L+萘乙酸0.1～0.3mg/L+蔗糖25～35g/L+琼脂6～8g/L+橄榄酸0.5～2.0mg/L+茉莉酸甲酯0.1～0.5mg/L，pH值5.8～6.0；
所述初代培养的条件为：20～30℃全暗培养2～4d后，转入20～30℃、13～15h光照/9～11h黑暗、光照强度2000～3000lx，培养20～22d。
5.根据权利要求1所述的快速选育方法，其特征在于，步骤（3）中，所述继代定向筛选培养基为：MS基础培养基+6-苄基腺嘌呤0.5～1.0mg/L+萘乙酸0.05～0.15mg/L+蔗糖25～35g/L+6～8g/L琼脂+橄榄酸1.0～3.0mg/L+茉莉酸甲酯0.2～0.8mg/L，pH值5.8～6.0；
所述继代培养的条件为20～30℃、13～15h光照/9～11h黑暗、光照强度2000～3000lx，培养18～22d。
6.根据权利要求5所述的快速选育方法，其特征在于，所述继代培养的次数为2～3次；所述初代培养和继代培养过程中，淘汰生长停滞、褐化坏死的幼嫩外植体和外植体。
7.根据权利要求1所述的快速选育方法，其特征在于，步骤（4）中，所述生根培养基为1/2MS基础培养基+吲哚乙酸0.5～1.0mg/L+活性炭0.3～0.7g/L+蔗糖15～25g/L+琼脂6～8g/L，pH值5.8～6.0；
所述生根培养的条件为20～30℃℃、11～13h光照/11～13h黑暗、光照强度1500～2000lx，培养周期13～17天。
8.根据权利要求1所述的快速选育方法，其特征在于，步骤（6）中，每次回交后代的筛选与繁育方法包括如下步骤：
1）将回交种子播种于温室中培育，诱导植物提前开花；
2）在盛花期检测苞片的THC和CBD含量，筛选出THC含量≤0.2%、CBD含量≥4.5%的单株作为回交母本；
3）将筛选出的回交母本与同期种植的轮回父本进行人工授粉、培育，收获下一代回交种子；
4）重复步骤1）～3），直至获得BC3F1代群体。
9.根据权利要求8所述的快速选育方法，其特征在于，步骤1）中，播种后设置温室的温度为25～28℃,相对湿度为60～70%，光照强度800～1200μmol/（m2·s），出苗后进行10h光照/14h黑暗处理。
10.权利要求1～9任意一项所述的快速选育方法在快速选育高CBD工业大麻中的应用。
技术领域
本发明涉及农作物遗传育种技术领域，尤其涉及一种高CBD工业大麻的快速选育方法。
背景技术
工业大麻是指四氢大麻酚(THC)含量≤0.3%的大麻品种，其体内的大麻二酚(CBD)具有抗炎、镇痛、抗焦虑、抗癫痫等多种药用价值。因此，高CBD、低THC是工业大麻品种选育的核心目标，其中CBD/THC比值是衡量品种药用价值与合规性的核心指标，比值越高，药用开发价值越强，合规风险越低。
目前工业大麻新品种选育仍以传统杂交育种为主，存在以下突出痛点：一是育种周期冗长，传统杂交育种需经过多代自交纯化、杂交组合筛选、多年多点鉴定，获得稳定品系通常需要6～8年，育种效率极低，难以快速匹配市场需求；二是现有定向筛选技术存在缺陷，分子标记辅助育种依赖高端设备与专业技术，检测成本高，难以规模化应用；离体诱变与多代组培筛选技术，易引发体细胞无性系变异，导致性状分离、倍性异常，甚至出现THC含量超标，品种稳定性难以保障，且多代组培操作繁琐，通量极低；三是现有品种核心指标偏低，难以满足高端药用开发需求；四是选育过程合规风险高，传统育种多在收获期进行有效成分检测，无法提前剔除THC超标单株，易导致最终品系大田种植时THC含量超出国家强制标准，引发监管风险。
因此，开发一种育种周期短、变异风险低、筛选通量高、性状定向性强、合规性有保障的低THC高CBD工业大麻快速选育方法，成为行业亟待解决的技术难题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高CBD工业大麻的快速选育方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种高CBD工业大麻的快速选育方法，包括如下步骤：
（1）选择THC含量≤0.2%、CBD含量≥1%作为母本，THC含量≤0.15%、CBD含量≥3%作为父本；
（2）将父本和母本进行正交和反交，得到正交F1代种子和反交F1代种子，混合构建F1代基础分离群体；
（3）选择F1代种子无菌萌发后的幼嫩外植体接入初代定向筛选分化培养基进行初代培养，得到不定芽；将不定芽转入继代定向筛选培养基中进行继代培养，得到复筛不定芽；
（4）将复筛不定芽接入生根培养基中进行生根培养，得到候选株系；
（5）将候选株系移栽至大田后检测其THC和CBD含量，将THC含量≤0.2%、CBD含量≥4.5%、CBD/THC比值≥20:1的单株作为轮回亲本；
（6）以轮回亲本为轮回母本、步骤（1）的父本作为轮回父本进行连续回交，直至获得BC3F1代群体；
（7）将BC3F1代群体进行连续两代自交纯化，得到高CBD工业大麻。
作为优选，步骤（3）中，所述无菌萌发的步骤为：将F1代种子进行消毒后，接入1/2MS固体培养基中，在20～30℃、12h光照/12h黑暗条件下培养至萌发。
作为优选，所述消毒的方法为：将F1代种子经70～80%乙醇消毒25～35s，无菌水冲洗2～4次，再经1～3%次氯酸钠溶液消毒8～12min，无菌水冲洗4～6次。
作为优选，所述初代定向筛选分化培养基为：MS培养基+6-苄基腺嘌呤1.0～2.0mg/L+萘乙酸0.1～0.3mg/L+蔗糖25～35g/L+琼脂6～8g/L+橄榄酸0.5～2.0mg/L+茉莉酸甲酯0.1～0.5mg/L，pH值5.8～6.0；
所述初代培养的条件为：20～30℃全暗培养2～4d后，转入20～30℃、13～15h光照/9～11h黑暗、光照强度2000～3000lx，培养20～22d。
作为优选，步骤（3）中，所述继代定向筛选培养基为：MS基础培养基+6-苄基腺嘌呤0.5～1.0mg/L+萘乙酸0.05～0.15mg/L+蔗糖25～35g/L+6～8g/L+橄榄酸1.0～3.0mg/L+茉莉酸甲酯0.2～0.8mg/L，pH值5.8～6.0；
所述继代培养的条件为20～30℃、13～15h光照/9～11h黑暗、光照强度2000～3000lx，培养18～22d。
作为优选，所述继代培养的次数为2～3次；
所述初代培养和继代培养过程中，淘汰生长停滞、褐化坏死的幼嫩外植体和外植体。
作为优选，步骤（4）中，所述生根培养基为1/2MS基础培养基+吲哚乙酸0.5～1.0mg/L+活性炭0.3～0.7g/L+蔗糖15～25g/L+琼脂6～8g/L，pH值5.8～6.0；
所述生根培养的条件为20～30℃℃、11～13h光照/11～13h黑暗、光照强度1500～2000lx，培养周期13～17天。
作为优选，步骤（6）中，每次回交后代的筛选与繁育方法包括如下步骤：
1）将回交种子播种于温室中培育，诱导植物提前开花；
2）在盛花期检测苞片的THC和CBD含量，筛选出THC含量≤0.2%、CBD含量≥4.5%的单株作为回交母本；
3）将筛选出的回交母本与同期种植的轮回父本进行人工授粉、培育，收获下一代回交种子；
4）重复步骤1）～3），直至获得BC3F1代群体。
作为优选，步骤1）中，播种后设置温室的温度为25～28℃,相对湿度为60～70%，光照强度800～1200μmol/（m2·s），出苗后进行10h光照/14h黑暗处理。
本发明提供了所述的快速选育方法在快速选育高CBD工业大麻中的应用。
有益效果：
本发明提供了一种高CBD工业大麻的快速选育方法，该方法通过高纯度亲本选配与正反交构建高分离潜力的F1代基础群体，采用橄榄酸联合茉莉酸甲酯构建有效成分合成定向代谢胁迫筛选体系，橄榄酸作为合成前体，可定向激活CBD合成通路，茉莉酸甲酯可调控合成关键酶的表达，二者协同作用，可在离体阶段精准筛选出CBD合成能力强、THC合成受抑制的基因型，大幅降低后续大田筛选工作量；仅在F1代完成1次离体定向筛选锁定核心目标基因型，从根源上降低了体细胞无性系变异、倍性异常的风险，保证了目标性状的稳定遗传；然后连续回交聚合了轮回父本的抗逆性、高花粉活力等优良性状最终选育的品系高CBD含量，株型整齐，分枝数适中，花期一致，适合我国主产区规模化标准化种植；而且后续回交世代采用温室短日照加代结合活体快速无损检测技术完成连续回交，无需重复组培操作，最终经自交纯化获得性状稳定的目标品系；
本发明将工业大麻新品种选育周期从传统的6～8年缩短至1.5～2年，大幅降低体细胞无性系变异风险，筛选通量提升20倍以上，育种成本显著降低；选育获得的品系四氢大麻酚(THC)含量稳定≤0.2%，大麻二酚(CBD)含量≥5.0%，CBD/THC比值稳定≥20:1，完全符合我国工业大麻监管标准，兼具高药用价值与优良农艺性状，适合规模化商业化育种与种植应用；
本发明无需高端分子生物学设备与复杂的基因编辑操作，常规种业公司与育种机构均可快速掌握并规模化应用，兼具技术创新性与产业实用性，可快速推动我国工业大麻品种升级与产业高质量发展。
具体实施方式
本发明提供了一种高CBD工业大麻的快速选育方法，包括如下步骤：
（1）选择THC含量≤0.2%、CBD含量≥1%作为母本，THC含量≤0.15%、CBD含量≥3%作为父本；
（2）将父本和母本进行正交和反交，得到正交F1代种子和反交F1代种子，混合构建F1代基础分离群体；
（3）选择F1代种子无菌萌发后的幼嫩外植体（子叶完全展开、真叶未长出的无菌苗子叶节）接入初代定向筛选分化培养基进行初代培养，得到不定芽；将不定芽转入继代定向筛选培养基中进行继代培养，得到复筛不定芽；
（4）将复筛不定芽接入生根培养基中进行生根培养，得到候选株系；
（5）将候选株系移栽至大田后检测其THC和CBD含量，将THC含量≤0.2%、CBD含量≥4.5%、CBD/THC比值≥20:1的单株作为轮回亲本；
（6）以轮回亲本为轮回母本、步骤（1）的父本作为轮回父本进行连续回交，直至获得BC3F1代群体；
（7）将BC3F1代群体进行连续两代自交纯化，得到高CBD工业大麻。
在本发明中，所述母本和父本均是连续2代以上自交纯化的工业大麻品系。
在本发明中，步骤（2）中，父本和母本的种子需要先进行定向预处理再播种；在现蕾期至初花期进行花期定向栽培调控，保证父母本花期完全相遇，同时强化亲本合成性状的稳定表达；
所述定向预处理包括梯度低温层积处理和混合调节剂浸种处理，具体为：将父本和母本的种子置于4℃中低温层积72h，再转入2℃中低温层积24h，完成梯度低温层积打破休眠；随后采用含0.05～0.2mg/L芸苔素内酯+0.5～1.5mg/L茉莉酸甲酯的无菌水溶液，在25℃避光条件下浸种12h，完成浸种处理；
所述芸苔素内酯的浓度优选为0.1～0.15mg/L，进一步优选为0.125mg/L；
所述花期定向栽培调控包括光周期调控与叶面喷施调控，具体为：在父本和母本现蕾期，采用10h光照/14h黑暗的短日照光周期调控，光照强度为800～1200μmol/（m2·s），优选为900～1100μmol/（m2·s），进一步优选为1000μmol/（m2·s）；同时在现蕾期、初花期分别叶面喷施1次含0.8～1.2mg/L水杨酸的水溶液，喷施量为每亩30～40L/亩，优选为33～37L/亩，进一步优选为35L/亩。
在本发明中，步骤（2）中，所述正交与反交均在100目及以上隔离网室中进行，授粉前彻底去除母本所有未开放的雄蕾，授粉期间每日人工辅助授粉1次，连续授粉3～5d，优选为4d，授粉完成后去除所有父本植株，待种子完全成熟后分别收获。
在本发明中，步骤（3）中，所述无菌萌发的步骤为：将F1代种子进行消毒后，接入1/2MS固体培养基中，在20～30℃、12h光照/12h黑暗条件下培养至萌发，温度优选为25℃。
在本发明中，所述消毒的方法为：将F1代种子经70～80%乙醇消毒25～35s，无菌水冲洗2～4次，再经1～3%次氯酸钠溶液消毒8～12min，无菌水冲洗4～6次；
所述乙醇浓度优选为75%；乙醇消毒时间优选为30s，冲洗次数优选为3次；
所述次氯酸钠溶液的浓度优选为2%，次氯酸钠溶液消毒优选为10min，冲洗次数优选为5次。
在本发明中，所述初代定向筛选分化培养基为：MS培养基+6-苄基腺嘌呤1.0～2.0mg/L+萘乙酸0.1～0.3mg/L+蔗糖25～35g/L+琼脂6～8g/L+橄榄酸0.5～2.0mg/L+茉莉酸甲酯0.1～0.5mg/L，pH值5.8～6.0；
所述6-苄基腺嘌呤的浓度优选为1.5mg/L，萘乙酸的浓度优选为0.2mg/L，蔗糖的浓度优选为30g/L，琼脂的浓度优选为7g/L，橄榄酸的的浓度优选为1.25mg/L，茉莉酸甲酯的浓度优选为0.3mg/L；
所述初代培养的条件为：20～30℃全暗培养2～4d后，转入20～30℃、13～15h光照/9～11h黑暗、光照强度2000～3000lx，培养20～22d；
全暗培养的温度优选为25℃,培养时间优选为3d；
光暗交替培养的温度优选为25℃,光照时间优选为14h光照/10h黑暗，光照强度优选为2500lx，培养时间优选为21d。
在本发明中，步骤（3）中，所述继代定向筛选培养基为：MS基础培养基+6-苄基腺嘌呤0.5～1.0mg/L+萘乙酸0.05～0.15mg/L+蔗糖25～35g/L+6～8g/L+橄榄酸1.0～3.0mg/L+茉莉酸甲酯0.2～0.8mg/L，pH值5.8～6.0；
所述6-苄基腺嘌呤的浓度优选为0.75mg/L，萘乙酸的浓度优选为0.1mg/L，蔗糖的浓度优选为30g/L，琼脂的浓度优选为7g/L，橄榄酸的的浓度优选为2mg/L，茉莉酸甲酯的浓度优选为0.5mg/L；
所述继代培养的条件为20～30℃、13～15h光照/9～11h黑暗、光照强度2000～3000lx，培养18～22d；
所述继代培养的温度优选为25℃,光照时间优选14h光照/10h黑暗，光照强度优选为2500lx，培养时间优选为20d。
在本发明中，所述继代培养的次数为2～3次，优选为3次。
所述初代培养和继代培养过程中，淘汰生长停滞、褐化坏死的幼嫩外植体和外植体。
在本发明中，步骤（4）中，所述生根培养基为1/2MS基础培养基+吲哚乙酸0.5～1.0mg/L+活性炭0.3～0.7g/L+蔗糖15～25g/L+琼脂6～8g/L，pH值5.8～6.0；
所述吲哚乙酸的浓度优选为0.75mg/L，活性炭的浓度优选为0.5g/L，蔗糖的浓度优选为20g/L，琼脂的浓度优选为7g/L；
所述生根培养的条件为20～30℃、11～13h光照/11～13h黑暗、光照强度1500～2000lx，培养周期13～17d；
所述生根培养的温度优选为25℃,光照时间优选12h光照/12h黑暗，光照强度优选为1750lx，培养时间优选为15d。
在本发明中，步骤（6）中，每次回交后代的筛选与繁育方法包括如下步骤：
1）将回交种子播种于温室中培育，诱导植物提前开花；
2）在盛花期检测苞片的THC和CBD含量，筛选出THC含量≤0.2%、CBD含量≥4.5%的单株作为回交母本；
3）将筛选出的回交母本与同期种植的轮回父本进行人工授粉、培育，收获下一代回交种子；
4）重复步骤1）～3），直至获得BC3F1代群体。
在本发明中，步骤1）中，播种后设置温室的温度为25～28℃,优选为26℃,相对湿度为60～70%，优选为65%，光照强度800～1200μmol/（m2·s），优选为900～1100μmol/（m2·s），进一步优选为1000μmol/（m2·s）出苗后进行10h光照/14h黑暗处理；
所述人工授粉通过在现蕾期至初花期进行花期定向栽培调控，保证父母本花期完全相遇。
本发明提供了所述的快速选育方法在快速选育高CBD工业大麻中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
在本发明的实施例和对比例中，在黑龙江省农业科学院大庆分院安达封闭育种基地开展实验；
实施例
实施例1 一种高CBD工业大麻的快速选育方法
（1）选择连续2代以上自交纯化的工业大麻品系作为亲本材料，其中母本为云麻7号，THC含量≤0.2%、CBD含量≥1%，父本为中汉麻1号，THC含量≤0.15%、CBD含量≥3%；
（2）将父本和母本的种子置于4℃中低温层积72h，再转入2℃中低温层积24h，完成梯度低温层积打破休眠；随后采用含0.1mg/L芸苔素内酯+1mg/L茉莉酸甲酯的无菌水溶液，在25℃避光条件下浸种12h，捞出沥干后播种；在父本和母本现蕾期，采用10h光照/14h黑暗的短日照光周期调控，光照强度为1000μmol/（m2·s）；同时在现蕾期、初花期分别叶面喷施1次含1.0mg/L水杨酸的水溶液，喷施量为每亩35L/亩，保证父本和母本花期完全相遇，同时强化合成性状的稳定表达；
将父本和母本种植于120目隔离网室中，分别开展正交和反交，授粉前彻底去除母本所有未开放的雄蕾，避免自交；授粉期间每日上午9～10点进行人工授粉1次，连续授粉4d，授粉完成后彻底清除所有父本植株，待种子完全成熟后，分别收获正交F1代种子和反交F1代种子，混合构建F1代基础分离群体；
（3）将F1代种子经75%乙醇消毒30s，无菌水冲洗3次，再经2%次氯酸钠溶液消毒10min，无菌水冲洗5次；然后接入1/2MS固体培养基中，在25℃、12h光照/12h黑暗条件下培养至萌发，选择F1代种子无菌萌发后的幼嫩外植体（子叶完全展开、真叶未长出的无菌苗子叶节）接入初代定向筛选分化培养基（MS培养基+6-苄基腺嘌呤1.5mg/L+萘乙酸0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+橄榄酸1.2mg/L+茉莉酸甲酯0.3mg/L，pH值6.0），在25℃全暗培养3d后，转入25℃、14h光照/10h黑暗、光照强度2500lx条件下初代培养21d，淘汰生长停滞、褐化坏死的外植体，保留分化旺盛、长势健壮的不定芽；将不定芽转入继代定向筛选培养基（MS基础培养基+6-苄基腺嘌呤0.8mg/L+萘乙酸0.1mg/L+蔗糖30g/L+7g/L+橄榄酸2.0mg/L+茉莉酸甲酯0.5mg/L，pH值6.0）中，在25℃14h光照/10h黑暗、光照强度2500lx条件下进行继代培养21d，连续继代2次，淘汰生长停滞、褐化坏死的外植体，保留分化旺盛、长势健壮的不定芽，得到复筛不定芽；
（4）将复筛不定芽接入生根培养基（1/2MS基础培养基+吲哚乙酸0.8mg/L+活性炭0.35g/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L，pH值5.9）中，在25℃、12h光照/12h黑暗、光照强度1800lx条件下，培养15d，得到候选株系；
（5）将候选株系移栽至大田，常规田间管理，盛花期去雌株顶端花序苞片，采用HPLC法检测THC和CBD含量，筛选出THC含量≤0.2%、CBD含量≥4.5%、CBD/THC比值≥20:1的单株作为轮回亲本；
（6）以轮回亲本为轮回母本、步骤（1）的父本作为轮回父本进行连续3代回交：
1）将回交种子播种于温室中，控制温度为26℃,相对湿度65%，光照强度1000μmol/（m2·s）；出苗后立即进行10h光照/14h黑暗处理，诱导植物提前开花；
2）在盛花期检测苞片的THC和CBD含量，筛选出THC含量≤0.2%、CBD含量≥4.5%的单株作为回交母本；
3）将筛选出的回交母本与同期种植的轮回父本进行人工授粉、套袋隔离，通过在现蕾期至初花期进行花期定向栽培调控，保证父母本花期完全相遇；授粉后继续培育至种子成熟，收获下一代回交种子；
4）重复步骤1）～3），12个月内完成3代回交，获得BC3F1代群体；
（7）将BC3F1代群体进行连续两代自交纯化，得到高CBD工业大麻。
实施例2 一种高CBD工业大麻的快速选育方法
（1）选择连续2代以上自交纯化的工业大麻品系作为亲本材料，其中母本为龙大麻5号，THC含量≤0.2%、CBD含量≥1%，父本为中汉麻1号，THC含量≤0.15%、CBD含量≥3%；
（2）将父本和母本的种子置于4℃中低温层积72h，再转入2℃中低温层积24h，完成梯度低温层积打破休眠；随后采用含0.05mg/L芸苔素内酯+0.5mg/L茉莉酸甲酯的无菌水溶液，在25℃避光条件下浸种12h，捞出沥干后播种；在父本和母本现蕾期，采用10h光照/14h黑暗的短日照光周期调控，光照强度为800μmol/（m2·s）；同时在现蕾期、初花期分别叶面喷施1次含0.8mg/L水杨酸的水溶液，喷施量为每亩40L/亩，保证父本和母本花期完全相遇，同时强化合成性状的稳定表达；
将父本和母本种植于100目隔离网室中，分别开展正交和反交，授粉前彻底去除母本所有未开放的雄蕾，避免自交；授粉期间每日上午9～10点进行人工授粉1次，连续授粉3d，授粉完成后彻底清除所有父本植株，待种子完全成熟后，分别收获正交F1代种子和反交F1代种子，混合构建F1代基础分离群体；
（3）将F1代种子经75%乙醇消毒30s，无菌水冲洗3次，再经2%次氯酸钠溶液消毒10min，无菌水冲洗5次；然后接入1/2MS固体培养基中，在25℃、12h光照/12h黑暗条件下培养至萌发，选择F1代种子无菌萌发后的幼嫩外植体（子叶完全展开、真叶未长出的无菌苗子叶节）接入初代定向筛选分化培养基（MS培养基+6-苄基腺嘌呤1.0mg/L+萘乙酸0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+橄榄酸0.5g/L+茉莉酸甲酯0.1mg/L，pH值5.8），在25℃全暗培养3d后，转入25℃、14h光照/10h黑暗、光照强度2500lx条件下初代培养21d，淘汰生长停滞、褐化坏死的外植体，保留分化旺盛、长势健壮的不定芽；将不定芽转入继代定向筛选培养基（MS基础培养基+6-苄基腺嘌呤0.5mg/L+萘乙酸0.05mg/L+蔗糖30g/L+7g/L+橄榄酸1.0mg/L+茉莉酸甲酯0.2mg/L，pH值5.8）中，在25℃、14h光照/10h黑暗、光照强度2500lx条件下进行继代培养21d，连续继代2次，淘汰生长停滞、褐化坏死的外植体，保留分化旺盛、长势健壮的不定芽，得到复筛不定芽；
（4）将复筛不定芽接入生根培养基（1/2MS基础培养基+吲哚乙酸0.5mg/L+活性炭0.5g/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L，pH值6.0）中，在25℃、12h光照/12h黑暗、光照强度1800lx条件下，培养15d，得到候选株系；
（5）将候选株系移栽至大田，常规田间管理，盛花期去雌株顶端花序苞片，采用HPLC法检测THC和CBD含量，筛选出THC含量≤0.2%、CBD含量≥4.5%、CBD/THC比值≥20:1的单株作为轮回亲本；
（6）以轮回亲本为轮回母本、步骤（1）的父本作为轮回父本进行连续3代回交：
1）将回交种子播种于温室中，控制温度为25℃,相对湿度70%，光照强度800μmol/（m2·s）；出苗后立即进行10h光照/14h黑暗处理，诱导植物提前开花；
2）在盛花期检测苞片的THC和CBD含量，筛选出THC含量≤0.2%、CBD含量≥4.5%的单株作为回交母本；
3）将筛选出的回交母本与同期种植的轮回父本进行人工授粉、套袋隔离，通过在现蕾期至初花期进行花期定向栽培调控，保证父母本花期完全相遇；授粉后继续培育至种子成熟，收获下一代回交种子；
4）重复步骤1）～3），14个月内完成3代回交，获得BC3F1代群体；
（7）将BC3F1代群体进行连续两代自交纯化，得到高CBD工业大麻。
实施例3 一种高CBD工业大麻的快速选育方法
（1）选择连续2代以上自交纯化的工业大麻品系作为亲本材料，其中母本为云麻7号，THC含量≤0.2%、CBD含量≥1%，父本为中汉麻1号，THC含量≤0.15%、CBD含量≥3%；
（2）将父本和母本的种子置于4℃中低温层积72h，再转入2℃中低温层积24h，完成梯度低温层积打破休眠；随后采用含0.2mg/L芸苔素内酯+1.5mg/L茉莉酸甲酯的无菌水溶液，在25℃避光条件下浸种12h，捞出沥干后播种；在父本和母本现蕾期，采用10h光照/14h黑暗的短日照光周期调控，光照强度为1200μmol/（m2·s）；同时在现蕾期、初花期分别叶面喷施1次含1.2mg/L水杨酸的水溶液，喷施量为每亩30L/亩，保证父本和母本花期完全相遇，同时强化合成性状的稳定表达；
将父本和母本种植于120目隔离网室中，分别开展正交和反交，授粉前彻底去除母本所有未开放的雄蕾，避免自交；授粉期间每日上午9～10点进行人工授粉1次，连续授粉5d，授粉完成后彻底清除所有父本植株，待种子完全成熟后，分别收获正交F1代种子和反交F1代种子，混合构建F1代基础分离群体；
（3）将F1代种子经75%乙醇消毒30s，无菌水冲洗3次，再经2%次氯酸钠溶液消毒10min，无菌水冲洗5次；然后接入1/2MS固体培养基中，在25℃、12h光照/12h黑暗条件下培养至萌发，选择F1代种子无菌萌发后的幼嫩外植体（子叶完全展开、真叶未长出的无菌苗子叶节）接入初代定向筛选分化培养基（MS培养基+6-苄基腺嘌呤2.0mg/L+萘乙酸0.3mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L+橄榄酸2.0g/L+茉莉酸甲酯0.5mg/L，pH值6.0），在25℃全暗培养3d后，转入25℃、14h光照/10h黑暗、光照强度2500lx条件下初代培养21d，淘汰生长停滞、褐化坏死的外植体，保留分化旺盛、长势健壮的不定芽；将不定芽转入继代定向筛选培养基（MS基础培养基+6-苄基腺嘌呤1.0mg/L+萘乙酸0.15mg/L+蔗糖30g/L+7g/L+橄榄酸3.0mg/L+茉莉酸甲酯0.8mg/L，pH值6.0）中，在25℃、14h光照/10h黑暗、光照强度2500lx条件下进行继代培养21d，连续继代2次，淘汰生长停滞、褐化坏死的外植体，保留分化旺盛、长势健壮的不定芽，得到复筛不定芽；
（4）将复筛不定芽接入生根培养基（1/2MS基础培养基+吲哚乙酸1.0mg/L+活性炭0.5g/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L，pH值6.0）中，在25℃、12h光照/12h黑暗、光照强度1800lx条件下，培养15d，得到候选株系；
（5）将候选株系移栽至大田，常规田间管理，盛花期去雌株顶端花序苞片，采用HPLC法检测THC和CBD含量，筛选出THC含量≤0.2%、CBD含量≥4.5%、CBD/THC比值≥20:1的单株作为轮回亲本；
（6）以轮回亲本为轮回母本、步骤（1）的父本作为轮回父本进行连续3代回交：
1）将回交种子播种于温室中，控制温度为28℃,相对湿度60%，光照强度1200μmol/（m2·s）；出苗后立即进行10h光照/14h黑暗处理，诱导植物提前开花；
2）在盛花期检测苞片的THC和CBD含量，筛选出THC含量≤0.2%、CBD含量≥4.5%的单株作为回交母本；
3）将筛选出的回交母本与同期种植的轮回父本进行人工授粉、套袋隔离，通过在现蕾期至初花期进行花期定向栽培调控，保证父母本花期完全相遇；授粉后继续培育至种子成熟，收获下一代回交种子；
4）重复步骤1）～3），11月内完成3代回交，获得BC3F1代群体；
（7）将BC3F1代群体进行连续两代自交纯化，得到高CBD工业大麻。
对比例1传统工业大麻杂交育种方法
采用传统杂交育种技术，以实施例1相同的父母本材料进行杂交，获得F1代种子，F1代自交获得F2代分离群体，连续进行6代自交纯化，每代均进行大田种植与HPLC检测，筛选低THC高CBD单株，最终获得稳定品系，总育种周期7年；最终品系THC含量0.21%～0.25%，CBD含量3.8%～4.2%，CBD/THC比值15.2:1～20.0:1，核心指标显著低于本发明实施例1，且存在THC含量接近国标临界值的合规风险，育种周期是实施例1的3倍以上。
对比例2多代组培重复筛选方法
以实施例1相同的父母本材料构建F1代分离群体，F1代完成离体初筛与复筛获得候选株系，后续每一代回交后代均重复离体组培筛选+大田鉴定流程，直至BC3F1代，再经2代自交获得稳定品系，总育种周期3.5年；最终品系出现明显的性状分离，群体整齐度仅82%，3.2%的单株THC含量超过0.3%，体细胞变异率达8.7%，存在明显的性状不稳定与合规风险，育种周期是实施例1的2倍以上。
由以上实施例可知，本发明提供了一种高CBD工业大麻的快速选育方法，该方法将工业大麻的选育周期短，大幅降低体细胞无性系变异风险，筛选通量提升20倍以上，育种成本显著降低，而且无需高端分子生物学设备与复杂的基因编辑操作。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
文章摘自国家发明专利，一种高CBD工业大麻的快速选育方法，发明人:车野，齐国超，王迪，姜泽宇，杨威，张玲，接思源，王明泽，承伟，申请号:202610426343.7，申请日:2026.04.02。
