摘 要:本发明公开了一种基于中红外光谱预测模型快速测定大麻二酚含量的方法，属于检测技术领域，该方法步骤流程包括对不同工业大麻产品进行的前处理、采集样品的红外光谱曲线、液相色谱法实测样品中大麻二酚含量、红外光谱数据的预处理及分析、建立模型、验证模型。本发明基于中红外光谱技术，结合PLS模型的预测能力和主成分分析的区分效果，可以对工业大麻提取物产品、花叶中的大麻二酚含量进行快速检测。信息量简洁丰富，且采用无损鉴别，操作简单，绿色环保，性能可靠，具有较低的相关耗材和维修成本，降低了运行成本和环保风险，节省大量的人力、物力、财力，适合推广使用。为快速测定不同工业大麻产品的大麻二酚含量提供了一种新方法。
权利要求书
1.一种基于中红外光谱预测模型快速测定大麻二酚含量的方法，其特征在于：该方法步骤流程包括：
(1)采集样品的红外光谱曲线；
(2)对步骤(1)得到的红外光谱曲线进行预处理，得到排除噪音干扰的中红外光谱数据；
(3)测定样品中大麻二酚含量；
(4)将步骤(3)得到的大麻二酚含量数据与步骤(2)得到的中红外数据进行回归建模得到大麻二酚含量的中红外预测模型；
(5)检测待测定样品的红外光谱曲线，代入步骤(4)得到的大麻二酚含量的中红外预测模型中，得到待检测样品的大麻二酚含量，完成所有检测。
2.根据权利要求1所述基于中红外光谱预测模型快速测定大麻二酚含量的方法，其特征在于：步骤(2)中预处理方法包括多元散射校正、偏差校正、平滑处理、变量标准化、一阶导数处理、二阶导数处理。
3.根据权利要求1所述基于中红外光谱预测模型快速测定大麻二酚含量的方法，其特征在于：步骤(4)所述的建模方法是指利用中红外光谱仪和超高效液相色谱两种高精密仪器所测得数据进行建模，首先将步骤(2)的中红外光谱数据，将其作为偏最小二程回归分析预测模型的预测值，再使用超高效液相色谱仪检测同批样品的大麻二酚含量，液相色谱所测数据作为偏最小二程回归分析预测模型的真实值，之后将两组数据进行回归建模，便可得到工业大麻中大麻二酚含量中红外光谱预测模型。
技术领域
本发明涉及一种基于中红外光谱预测模型快速测定大麻二酚含量的方法，属于检测技术领域。
背景技术
工业大麻是在中国传统种植的“火麻”或称“汉麻”，基础上培育的，植物干花叶中化学成分△9 四氢大麻酚含量小于0.3％Wt，可针对纤维用、籽用或花叶提取等工业应用的低毒大麻品种。其中以大麻二酚为代表的大麻素类化学物质被发现具有抗抑郁、抗精神病、抗炎、神经系统保护等多种药理活性，近年来对工业大麻花叶中的药用成分提取加工和应用开发也非常多，因此国内外种质研发机构纷纷研究和生产出多种高大麻二酚、低△9 四氢大麻酚含量的工业大麻产品，其中，全谱油作为一种典型的工业大麻提取物产品，它包含多种活性成分，这些成分共同作用产生了全谱油独特的药理活性，因其广泛的健康益处在医药、保健品行业而备受青睐，所以市面上也催生出了很多的全谱油假冒伪劣产品。本发明专利的目的在于研究工业大麻和衍生产品的红外光谱特性，建立一种快速、准确、简便的工业大麻产品、品种鉴别方法。
中红外光谱分析技术作为一种快速检测技术具有分析时间短、操作简单、分析成本低等优势，近年来在食品药品的质量分析、真假鉴定和产地鉴别等方面应用越来越广泛。本发明对工业大麻提取全谱油、花叶泡酒和工业大麻花叶的红外光谱特性进行了研究，利用红外光谱技术和数据处理软件进行大麻二酚含量的预测和主成分分析。采用本研究的红外快检技术可对不同样品进行快速区分和CBD含量的快速定量，具有很好的实际应用价值。
目前检测大麻二酚含量常用的方法通常是液相色谱法(HPLC)或液相色谱 质谱联用仪(LC-MS)分析，这些方法存在成本较高(流动相消耗多且存在环境污染，维护成本大)、分析时间长、检测量小等问题，但使用本发明提供的方法刚好可以解决这些问题，本发明使用便携式红外光谱分析仪进行测定，设备维护简单，检测方法快速、简便，并且有效避免了液相色谱或质谱检测过程中使用流动相对环境造成的污染。
发明内容
为了解决现有大麻二酚在检测过程中存在的问题，本发明提供另一种基于中红外光谱预测模型快速测定大麻二酚含量的方法，该方法步骤流程包括：
(1)采集样品的红外光谱曲线。
(2)对步骤(1)得到的红外光谱曲线进行预处理，得到排除噪音干扰的中红外光谱数据。
(3)测定样品中大麻二酚含量。
(4)将步骤(3)得到的大麻二酚含量数据与步骤(2)得到的中红外数据进行回归建模得到大麻二酚含量的中红外预测模型。
(5)检测待测定样品的红外光谱曲线，代入步骤(4)得到的大麻二酚含量的中红外预测模型中，得到待检测样品的大麻二酚含量，完成所有检测。
优选的，步骤(1)中，当样品为液体时取0.1克溶解于2mL75％乙醇溶剂中，超声处理15min，取50uL于2毫米厚溴化钾压片上，再将另一个压片压上去作为背景，然后放置到检测窗口待测得到样品的红外光谱曲线。
优选的，步骤(1)中，当样品为固体时，将样品清洗、烘干、粉碎、过筛，称取过筛得到粉末样品0.1克，均匀平铺于测试台上检测得到样品的红外光谱曲线。
优选的，步骤(1)中中红外光谱的采集条件为：扫描范围700～3800cm 1，每个样品采集3次。中红外光谱分析仪为美国安捷伦ATR Cary 630FTIR便携式光谱仪，数据采集软件为Agilent MicroLab PC Software。
优选的，步骤(2)中数据处理软件为Agilent MicroLab Expert Software，版本1.1.0.1，经预处理后剔除异常样品数据，获得工业大麻不同样品的排除噪音干扰的中红外光谱曲线。红外光谱预处理的方法包括多元散射校正(Multiplicative Scatter Correction，MSC)、偏差校正(Deviation correction)、平滑处理、变量标准化、一阶导数处理、二阶导数处理。
优选的，步骤(3)中大麻二酚含量通过超高效液相色谱Agilent Technologies 1290 Infinity测得。
优选的，步骤(4)所述的建模方法是指利用中红外光谱仪和超高效液相色谱两种高精密仪器所测得数据进行建模，首先将步骤(2)的中红外光谱数据，将其作为偏最小二程回归分析预测模型的预测值，再使用超高效液相色谱仪检测同批样品的大麻二酚含量，液相色谱所测数据作为偏最小二程回归分析预测模型的真实值，之后将两组数据进行回归建模，建模软件为Agilent MicroLab Expert Software，版本1.1.0.1，便可得到工业大麻中大麻二酚含量中红外光谱预测模型。
本发明的有益效果
(1)该方法操作简单，在建立模型之后，只需对操作人员简单培训即可，光谱数据带入模型即可直接得到结果，无需专业人员，检测速度快，检测成本低廉，很适合推广应用。
附图说明
图1为工业大麻的中红外原始光谱图。
图1
图2为光谱预处理图，其中(1)为多元散射校正(Multiplicative Scatter Correction，MSC)；(2)为偏差校正(Deviation correction)；(3)为平滑处理(SG)；(4)为变量标准化(SNV)；(5)为一阶导数处理；6.二阶导数处理。
图2
图3为工业大麻主成分分析图，其中(1)为2种工业大麻产品和花叶(花叶提取全谱油、花叶泡酒、工业大麻花叶)的主成分分析图；(2)为三种全谱油产品主成分分析图；(3)为三种花叶的主成分分析图。
图3
图4为不同区域工业大麻的聚类分析图。
图4
图5为工业大麻中大麻二酚含量中红外光谱预测模型。
图5
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。但下述的实施例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
实施例中使用的仪器：安捷伦ATR Cary630 FTIR便携式光谱仪；超高效液相色谱Agilent Technologies 1290 Infinity；数据处理软件：Agilent MicroLab Expert Software，版本1.1.0.1；MetaboAnalyst5.0。
下列实施方式中，根据中红外扫描数据以及液相色谱测定数据建立模型。实验所用样品包括工业大麻提取全谱油、花叶泡酒和工业大麻花叶，均由云南工业大麻种植加工企业和云南工业大麻协会提供。
实施例1
一种中红外光谱预测模型的建立，具体步骤如下所述：
(1)采集检测样品的中红外光谱曲线：
A.将工业大麻提取全谱油、工业大麻花叶泡酒各取0.1克溶解于2mL75％乙醇溶剂中，超声处理15min，待用。
B.将步骤(A)处理后的工业大麻提取全谱油和工业大麻花叶泡酒样品使用移液枪分别滴50uL于溴化钾压片上，再将另一个背景压片压上去，然后放置到检测窗口测试，每个样品重复三次，
C.工业大麻花叶样品前处理方法为清洗、烘干、粉碎、过筛。称取过筛得到花叶粉末样品0.1克，均匀平铺于测试台准备待测，检验时间为30秒，每个样品重复三次，每次测样后均用95％酒精擦拭检测窗口。
得到的中红外原始光谱图如图1所示。
(2)对步骤(1)得到的中红外原始光谱图进行预处理，得到排除噪音干扰的中红外光谱数据，具体为将步骤(1)得到的每个样品的3个重复中红外原始光谱图进行散射校正和预处理，包括多元散射校正(Multiplicative Scatter Correction，MSC)、偏差校正(Deviation correction)、平滑处理(SG)、变量标准化(SNV)、一阶导数处理、二阶导数处理，处理结果如图2所示，其中图2(1)为多元散射校正(Multiplicative Scatter Correction，MSC)结果；图2(2)为偏差校正(Deviation correction)处理结果；图2(3)为平滑处理结果；图2(4)为变量标准化处理结果；图2(5)一阶导数处理；图2(6)二阶导数处理。
(3)测定样品中大麻二酚含量：采用超高效液相色谱测定样品中大麻二酚含量，具体步骤为：
A.标准曲线的制备
称取1ml浓度1000ug/ml的大麻二酚标准溶液至10ml容量瓶中，并定容至刻度线，制得200ug/ml的标准溶液，并放置在 20℃下的冰箱内避光冷藏待用，后续标准工作溶液分析设置5个不同梯度进样(0.2μL，0.5μL，1μL，2μL，5μL)。
B.样品分析
称量工业大麻花叶粉末样品0.2g，使用95％甲醇 水溶液提取，定容10mL，超声30min，12000r/min离心5min，取出上清液，过0.22μm的有机系滤膜过滤，再将滤液转移至色谱进样瓶中上机分析。HPLC条件设置：Waters Acquity BEH C18色谱柱(2.1mm×50mm，1.7μm)；流动相A为0.1％磷酸水溶液，B为甲醇溶液，等度洗脱：75％B，流速0.30ml/min，色谱柱温：30℃；进样量设置为1μL。并考察所检测样品处理液浓度是否在标准曲线范围之内，若不在，需稀释或浓缩样品处理液。
C.样品含量计算公式
标准工作溶液的峰面积作为y，并与其相对应的标准浓度进行回归分析，可得标准曲线：y＝6.9806x 3.6129，R2＝0.9997。再根据峰面积之比对于浓度之比，即可算出大麻二酚的实际含量，所有样品大麻二酚的实际含量如表1所示。
表1 样品中大麻二酚含量的实测结果
(4)将步骤(2)得到的中红外光谱数据，将其作为偏最小二程回归分析预测模型的预测值，再使用超高效液相色谱仪检测同批样品的大麻二酚含量，液相色谱所测数据作为偏最小二程回归分析预测模型的真实值，之后将两组数据进行回归建模，建模软件为Agilent MicroLab Expert Software，版本1.1.0.1，便可得到工业大麻中大麻二酚含量中红外光谱预测模型。
对不同条件下建立的模型进行比较，选择定标模型交叉验证偏差(SEC)小，预测均方根误差(RMSE)小，交叉验证相关系数R大的模型。对不同条件下建立的模型进行比较，选择定标模型交叉验证偏差(SEC)小，预测均
方根误差(RMSE)小，交叉验证相关系数R大的模型。不同处理条件的比较如表2所示。最终选择MSC+SG+SNV+2阶求导，所得线性方程为y＝0.97647612*x+0.01719390。
表2 不同处理方法
实施例2
模型准确性预测
将待检测的工业大麻样品的红外光谱数据导入到中红外预测模型当中，如图5所示，筛选出其中不同产地的工业大麻所得结果进行验证，并将这些数据分为校正集和验证集，通过内部交叉验证的方式对模型的预测能力进行验证，分别计算出每一个校正集和验证集的准确率及相对标准偏差，以及交叉验证相关系数(R2)、残差，最后求平均值，结果如表3所示。准确率越高、相关系数越大说明模型预测效果越好，所有校正集和验证集准确率均在80％以上，相对标准偏差均低于28％，表明该模型可以成功使用。
相对标准偏差RSD计算公式为
验证集、校正集的准确率(A)计算公式为
将预测模型所计算出的每一个校正集、验证集的预测含量导入EXCEL表格中，利用STDEV函数计算出标准偏差，代入RSD计算公式即可得到RSD值。
准确率计算公式中，|V|为每个样品点残差的绝对值。|P|为每个样品点的预测值。残差等于液相色谱所测的真实值减去预测模型所测的预测值，计算出每一个验证集、校正集的准确率后，再求平均值，最终所得结果作为模型准确率判断依据。
表3 PLS模型的准确率及RSD值(工业大麻花叶样品)
为进一步验证红外光谱检测的准确性，我们将实施例1中步骤(1)所得的原始光谱数据直接导入主成分分析模型(PCA)中，分析是否可以有效区分不同品种。结果表明，该模型对于品种区分效果良好，可有效判别工业大麻不同品种，但缺点是无法对大麻二酚含量进行定量，结果如图3所示，图3(1)区分出了两类工业大麻产品和花叶的区别(全谱油、工业大麻花叶泡酒杜、工业大麻花叶)。图3(2)区分出了同种全谱油但不同含量的区别。图3(3)区分出了工业大麻不同品种的区别(云麻7号、云麻8号、云麻10号)。该模型可证明红外光谱检测的准确性，同时可为工业大麻产品真假鉴别、品种区分提供一种依据。
根据实施例1中步骤(1)所得的原始光谱数据，还可对产地来源进行验证，方法是通过建立聚类分析模型，可明显区分出工业大麻6个产地的区别(楚雄、曲靖、寻甸、玉溪、保山、昆明、倘甸)，区分效果明显、结果准确，同时可为产地溯源提供依据，模型如图4所示。
实施例3真实值与预测值的比较
使用超高效液相色谱法检测样品的大麻二酚含量作为真实值，中红外光谱预测模型为预测值，全谱油样品的CBD含量预测标准差为4.94，标准误差为1.71，花叶酒的CBD含量预测标准差为0.02，标准误差为0.01，工业大麻花叶的CBD含量预测标准差为0.29，标准误差为0.016，所有样品的交叉验证系数均大于0.9，表明模型可以成功使用。工业大麻样品中的大麻二酚含量的真实值与预测值的比较如表4所示。
表4 22个样品详细信息
模型应用
对待检测样品进行检测，实验值与预测值相关性图见如图5所示，全样品预测值和实验值的R均达到0.9以上，具有较高的预测准确性，说明模型可用于大麻花叶中大麻二酚含量的快速测定和初步筛选。
文章摘自国家发明专利，一种基于中红外光谱预测模型快速测定大麻二酚含量的方法，发明人:李晓蕾，张浩，蔡尤西，张瑞婷，江茜，申请号:202411427449.6，申请日:2024.10.14。
