摘 要：KH结构域蛋白参与调控植物开花时间、花器官形成、叶发育、miRNA产生和对生物非生物胁迫的响应。前期实验发现AhKH1775可能参与调控剑麻株芽的发育，但是其调控机制仍不清楚。KH结构域蛋白可以通过复合体的方式参与转录后基因表达调控。为获得与AhKH1775相互作用的蛋白，本研究克隆AhKH1775的完整编码框，构建了酵母双杂交诱饵载体，并检测诱饵载体的毒性和自激活性。克隆获得一个918bp的编码框，成功构建了诱饵载体，诱饵载体无毒性，但存在自激活性，25mmol/L的3-AT可以抑制诱饵载体的自激活性。结果为进一步筛选与AhKH1775相互作用的蛋白和深入研究AhKH1775在剑麻中的功能提供依据基础。
关键词：剑麻；KH结构域；基因克隆；酵母双杂交；诱饵载体
KH结构域首次在人类的核不均一性核糖核蛋白K(humanheterogeneousnuclearribonucleoproteinK，hnRNPK)蛋白中被鉴定(Siomietal.，1993)，该结构域由大约60个氨基酸组成，含有一个高度保守 啊·VIGxxGxxI基序(Christopheretal.，1994)。TypeI型KH结构域分成4个亚类：vigilin类，poly-nucleotidephosphorylase(PNPase)类，poly(C)-bindingprotein(PCBP)类和splicingfactor1(SF1)类(Buckneretal.，2008)KH结构域广泛分布于细菌和真核生物的核糖体蛋白、转录调控等蛋白中，拟南芥中发现26个KH结构域的蛋白(Lorkovi?andBarta，2002)。含KH结构域的蛋白参与了植物多个生理事件。调控植物发育，如HEN4(含一个KH结构域)与HUA1相互作用(细胞核内CCCH锌指结构域RNA结合蛋白)促进AGAMOUS类MADS基因的pre-mRNA加工，参与花形态建成(Chengetal.，2003)；FLC(KH结构域蛋白)通过上调FLC(MADS-box家族基因)基因表达，影响开花时间(Daietal.，2020)；PEP(含有三个KH结构域)负调控FLC表达，抑制开花(Ripolletal.，2009)。介导生物非生物胁迫，如KH结构域蛋白FLK介导水杨酸和活性氧信号，调控植物对病原菌的防御(Fabianetal.，2021)；typII型KH结构域蛋白、叶绿体核酸内切酶UVI31响应紫外光胁迫(Routetal.，2018)；RCF3(含有多个KH结构域)与CPL1相互作用介导转录调控，响应冷胁迫(Jeongetal.，2013)；免疫负调控蛋白StKH17(KH结构域蛋白)与免疫正调控蛋白StPUB17(E3连接酶)结合，并被蛋白酶体降解(Mclellanetal.，2020)。调节植物miRNA的产生，如RCF3与CPL1和CPL2相互作用，调控HYL1活性(Karlssonetal.，2015)。剑麻是天门冬科单次开花多年生植物，可进行有性和无性繁殖，以应对极端干旱和高温的环境(Davisetal.，2019)。花脱落后发育的株芽是剑麻无性繁殖的主要形式，单株可形成几百至上千颗株芽(Tookeetal.，2005)。株芽在母株上发育形成完整的根茎叶结构，这种繁殖方式在自然界较少见，目前对株芽的发育机制了解的还不多。已有研究报道classI类KNOX基因参与了剑麻株芽的发育，在株芽发育的起始阶段AhKNOX2会上调表达(Abraham-Juárezetal.，2010)。所以我们用AhKNOX2为诱饵从剑麻酵母cDNA表达文库中获得一个含有KH结构域的互作蛋白，命名为AhKH1775(Yang et al.，2020)。KH结构域蛋白参与植物发育，推测AhKH1775可能参与了剑麻株芽的发育，但是其具体的调控机制还不清楚。鉴于已发现含有KH结构域的蛋白能形成蛋白复合体发挥调控作用，本研究克隆了AhKH1775基因的完整编码框，构建了AhKH1775的酵母双杂交诱饵载体，并检测其毒性和自激活性。结果为下一步筛选与AhKH1775相互作用的蛋白提供研究基础。
1结果与分析
1.1生物信息分析
生物信息学分析显示，KH1775基因编码区长度为918bp，编码氨基酸280个，分子量为31.017kD、等电点为8.83。KH1775蛋白的亲水性数值为负值，说明KH1775蛋白为疏水性蛋白(表1)。通过在线网站NCBI中的Conserved Domains做保守结构域分析，结果显示，KH1775蛋白的132~232个氨基酸之间含有一个KH-I_SPIN1_like结构域，表明它属于KH-Ⅰ超家族(图1)，通过protein BLAST进行比对，在比对结果中选取相似性高且含有KH-Ⅰ结构域的9个其他物种序列下载保存。使用DNAMAN软件，对KH1775蛋白和9个其他物种的KH蛋白序列进行同源性分析，显示，KH1775蛋白与Asparagusofficinalis(XP_020241251.1)聚为一支(图2A)，说明剑麻中的KH1775蛋白在同源性上与芦笋中的XP_020241251.1最为接近，通过绘制系统发育树(图2B)，我们发现Asparagusofficinalis(XP_020241251.1)同样与KH1775蛋白聚为一支，说明他们在进化关系上最为相似。
表1 KH1775 基因理化性质
图1 KH1775蛋白保守结构域
1.2AhKH1775编码框扩增及鉴定
通过分析基因组序列，发现AhKH1775完整编码框长度为918bp。通过PCR扩增，获得与预期长度一致的DNA片段(图3A)。将测序序列与基因组序列比对，结果表明克隆序列与基因序列一致(图4)。
1.3诱饵载体的构建及鉴定
利用相同的限制性内切酶处理目的片段和pGBKT7载体，并将片段连接至pGBKT7载体多克隆位点。EcoRⅠ和BamHⅠ的双酶切显示，酶切产物出现大的载体条带和小的目标序列条带，目标序列条带和预期一致(图3B)；测序序列与克隆序列一致。表明成功构建了诱饵载体。
图2 不同物种的KH蛋白的同源树与系统发育树
图3 PCR产物电泳检测和重组质粒PGBKT7-AhKH1775酶切鉴定
注:M:DL2000DNAMarker;M*:DL5000DNAMarker;1:PCR产物;2:重组质粒的酶切产物
图4 基因KH1775序列
1.4诱饵载体毒性检测
将携带诱饵载体的酵母菌和携带空载体PGBKT7的酵母菌分别涂布于SD/-Trp固体平板和接种液体SD/-Trp培养基。经培养，结果显示，携带pGBKT7-AhKH1775重组载体的酵母菌与对照在SD/-Trp固体培养基生长大小无差异(图5A)；携带pGBKT7-AhKH1775重组载体的酵母菌与对照在液体SD/-Trp培养基中的生长趋势一致(图5B)。结果说明pGBKT7-AhKH1775对酵母菌没有毒性。
图5 pGBKT7-AhKH1775诱饵载体毒性检测
注:A:酵母菌在SD/-Trp平板上的生长情况;B:酵母菌的生长曲线
1.5诱饵表达载体自激活检测
为检验诱饵载体的自激活活性，我们将携带pGBKT7-AhKH1775重组载体的酵母菌和三种对照(空载体对照,阴性对照,阳性对照)的酵母菌分别涂布于SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Trp/-His和SD/-Trp/-Ade固体平板。结果表明，携带pGBKT7-AhKH1775重组载体的酵母菌可以在SD/-Trp和SD/-Trp/-His上生长，说明诱饵载体有自激活性(图6)。
图6 pGBKT7-AhKH1775自激活检验
1.63-AT抑制浓度筛选
为了筛选最佳3-AT抑制浓度，将携带pGBKT7-AhKH1775重组载体的酵母菌分别涂布于含0、5、10、25和50mmol/L3-AT的SD/-Trp/-His平板。结果显示携带pGBKT7-AhKH1775重组载体的酵母菌可以在0、5和10mmol/L的SD/-Trp/-His平板上生长，而在25和50mmol/L的SD/-Trp/-His平板不生长(图7)。说明25mmol/L的3-AT就能抑制诱饵载体的自激活活性。
图7 不同浓度3-AT下酵母菌生长状况
2讨论
现有研究报道KH结构域蛋白参与调控植物开花、花器官的形成和叶发育等事件。在拟南芥中，HEN4蛋白可以促进AGAMOUS类MADS基因的pre-mRNA 加工，影响花器官发育(Cheng et al.,2003)；PEP蛋白能够在调控营养器官生长以及雌蕊发育过程中发挥重要作用(Ripoll et al.,2006)。研究发现，KH结构域蛋白可以通过蛋白质间相互作用来行使其功能。拟南芥和玉米的 SF1-like KH结构域蛋白被命名为Roughsheath2-Interacting KH domain (RIK)蛋白，玉米RIK蛋白可以与Maize rough sheath 2(RS2)相互作用，而拟南芥RIK可以与asymmetric leaf1(AS1)相互作用。玉米RS2又与细胞周期调节缺陷同源蛋白A(cell cycleregulation defective homolog A,HIRA)相互作用，形成RIK-RS2/AS1-HIRA染色质重塑复合物，抑制茎尖分生组织外围区域内的KNOX基因，是叶片正常发育所必需的(Buckner et al.,2008)，表明KH结构域蛋白调控KNOX基因表达。剑麻AhKNOX2参与株芽发育，在株芽发育起始和发育阶段上调表达(Abraham-Juárezet al.,2010)。我们以AhKNOX2为诱饵载体从剑麻cDNA表达文库中筛选获得一个KH结构域蛋白(Yang et al.,2020)，暗示KH结构域蛋白可与AhKNOX2直接相互作用。尽管如此，KH结构域蛋白在剑麻中的功能依然知之甚少。
3材料与方法
3.1试验材料
酵母培养和转化试剂购自Clontech公司；BamHⅠ、EcoRⅠ、pMD19-T载体购自TaKaRa公司。实验用的化学试剂均购自Sigma公司。PCR产物纯化试剂盒、普通质粒小提试剂盒购自天根生物公司。PCR试剂购自莫纳生物公司。引物的合成及测序，由广州艾基生物技术有限公司完成。
3.2生物信息学分析
将前期研究所得的KH1775基因序列用DNAMAN软件进行氨基酸翻译，并在NCBI上用ProteinBLAST进行同源序列比对，用Conserved Domains做保守结构域分析，下载同源序列用DNAMAN软件进行比对分析并制作同源树与进化树。利用在线软件Expasy中的Protparam工具预测蛋白质分子式、分子量、理论等电点和亲水性等基础信息。
3.3AhKH1775编码框的扩增
设计特异引物(表2)，以剑麻主栽品种H.11684的mRNA反转录的cDNA为模板，用新合成的特异引物来进行PCR扩增AhKH1775的编码框，反应体系如下：2×PCRBuffer20μL，cDNA模板1μL，上下游引物各0.5μL，用无菌水补齐至40μL。PCR程序扩增为：94℃反应3min；98℃反应30s，58℃反应30s，72℃反应1min，35个循环；72℃反应5min。用1%琼脂糖凝胶，电泳检测扩增产物。将PCR产物连接pMD19-T载体，转化大肠杆菌DH5α，对阳性克隆测序。
表2 实验所需引物
3.4诱饵载体pGBKT7-AhKH1775的构建与鉴定
用EcoRⅠ和BamHⅠ限制性内切酶对pMD19-T-AhKH1775重组质粒和pGBKT7载体分别进行双酶切，之后用NDA凝胶回收试剂盒(中科瑞泰)进行回收纯化，用SolutionⅠ试剂在16℃过夜连接，随后将连接产物用热激法转化至大肠杆菌DH5α中，将含有转化子的菌液涂布在LB固体培养基上(含有50μg/mL的Kan抗生素)，37℃恒温箱内培养(12h)过夜后，从培养基上挑取单菌落至含Kan的液体LB培养基中，200r/min振荡培养12h左右，对其进行菌落PCR检测，将阳性菌液扩大抽提质粒，用EcoRⅠ和BamHⅠ进行双酶切鉴定并测序，序列结果比对正确则表明诱饵载体构建成功。
3.5诱饵载体转化Y2HGold酵母菌株
参考Clontech酵母转化手册，采用LiAC法将pGBKT7-AhKH1775以及空载pGBKT7质粒转化Y2HGold酵母细胞。转化菌液均匀涂布在SD/-Trp平板上，30℃，倒置培养3d。挑取单菌落进行PCR验证。
3.6诱饵载体的毒性检测
如果KH1775蛋白在酵母中表达的过程中产生对酵母的毒害作用，将对后续互作蛋白筛选产生影响，并且有毒性的蛋白，会使其酵母菌液OD600通常不超过1.0。所以我们将携带诱饵载体的酵母菌和携带空载体pGBKT7的酵母菌分别涂布于SD/-Trp固体平板，恒温培养箱30℃，倒置培养3d。观察酵母菌大小。并且我们将携带诱饵载体的酵母菌和携带空载体pGBKT7的酵母菌分别接种于5mLSD/-Trp液体培养基，200r/min，30℃振荡培养。每隔4个小时测定培养液OD600吸光度。
3.7诱饵载体的自激活检测及3-AT抑制浓度筛选
在酵母文库筛选试验中，如果不在前期进行自激活检测，而直接进行文库筛选，极有可能得到众多的假阳性转化子，增加后续处理数据的难度，并且影响试验结果的可信度。因此我们将携带诱饵载体的酵母菌和携带空载体pGBKT7的酵母菌涂布于SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Trp/-His和SD/-Trp/-Ade固体平板，30℃，恒温培养3d，检测自激活活性。3-AT是组氨酸的竞争性抑制剂，能够抑制HIS3的泄露表达以及轻微自激活现象。如果诱饵载体存在自激活性，将其酵母菌涂布于含0、5、10、25和50mmol/L3-AT的SD/-Trp/-His平板，30℃，恒温培养3d，观察酵母是否有生长。
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文章摘自：汪询,杨倩,柯智,周文钊,杨子平,吕玲玲.剑麻AhKH1775基因克隆及其酵母双杂交诱饵载体构建[J/OL].分子植物育种:1-13[2022-11-12].http://kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.s.20221008.1830.020.html
