摘 要：本发明提供一种特异性检测剑麻cDNA中基因组DNA残留的引物及其方法和应用。本发明在剑麻各组织中稳定表达的管家基因中发现一个β-ACTIN基因，通过比对该基因组DNA序列与cDNA序列，发现在剑麻β-ACTIN基因中存独特的序列差异。基于此，本发明开发出一对特异性引物，能够基于扩增片段长度的差异，在普通琼脂糖凝胶电泳中能对剑麻cDNA与gDNA进行明确区分，并且在不同来源和品种的剑麻中均能准确检测出gDNA污染残留。该检测引物具有特异性高、稳定性好、泛用性强、检测方法简便和经济实惠等优点，为评估剑麻RNA提取质量及保障后续分子实验数据的可靠性提供了高效、特异的标准化质控工具。
权利要求书
1.一种特异性检测gDNA污染残留的引物,其特征在于,包括上游引物5'-CAgTggTCgTACAACTggTAT-3'和下游引物5'-ATCCTCCAATCCAgACACTgT-3'?
2.权利要求1所述引物在特异性检测剑麻中gDNA污染残留中的应用。
3.权利要求1所述引物在制备检测剑麻中gDNA污染残留、或在鉴定或区分剑麻cDNA与gDNA的产品中的应用。
4.一种检测试剂盒，其特征在于，含权利要求1所述引物。
5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有PCR扩增试剂。
6.权利要求4或5所述试剂盒在特异性检测剑麻中gDNA污染残留、或在鉴定或区分剑麻cDNA与gDNA中的应用。
7.一种鉴定剑麻cDNA中基因组DNA残留的方法，其特征在于，采用权利要求1所述引物对剑麻cDNA进行扩增检测，若待测样本中扩增出700±25bp的条带，则说明样本中存在gDNA污染。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述扩增检测的程序为：95℃ 3min，95℃ 10s，65℃ 20s，72℃ 5min，35个循环。
9.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述扩增检测的反应体系为：10μL2×Taq-AS PCR Mix，0.5μLcDNA，上下游引物各0.25μL，加ddH2O补至总体积为20μL。
10.检测剑麻β-ACTIN基因的试剂在检测剑麻中gDNA污染残留、或在制备特异性检测剑麻中gDNA污染残留、或在鉴定或区分剑麻cDNA与gDNA的产品中的应用，其特征在于，所述β-ACTIN基因的基因号为EVM0008077。
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，具体而言，涉及一种特异性检测剑麻cDNA中基因组DNA残留的引物及其方法和应用。
背景技术
剑麻是天门冬科（Asparagaceae）龙舌兰亚科（Subfamily agavoideae）植物的统称，是一种多年生热带硬质叶纤维作物，其纤维具有坚韧、耐磨、耐海水腐蚀等优异特性，是国防、航海、工农业等领域不可或缺的重要天然纤维原料。我国是全球主要的剑麻生产国之一，然而剑麻作为近现代从国外引进的作物，基础研究薄弱，遗传背景复杂，技术平台和专业人才缺失，导致近50年来我国剑麻育种研究仍以传统育种为主。剑麻传统育种周期长达8至30年，严重制约了育种效率。
分子辅助育种和基因工程技术是缩短育种周期、提高育种效率的关键途径。在剑麻功能基因研究中，通过提取组织总RNA、经反转录获得互补DNA（cDNA）进行基因表达分析、基因克隆等实验是常规且核心的技术流程。该流程的准确性高度依赖于所获cDNA模板的纯度。然而，在RNA提取过程中，痕量的基因组DNA（gDNA）残留污染是一个普遍存在的技术难题。
剑麻是纤维作物，植株中富含阿拉伯半乳聚糖、木聚糖、木葡聚糖等多糖，同时也富含新替告皂苷元、海柯皂苷元、剑麻皂苷元等十余种酚类物质，是一种典型多糖多酚植物。多糖与核酸的理化性质相似，在乙醇或异丙醇沉淀时会与RNA共沉淀，形成黏稠的胶状物，这不仅降低RNA得率，还会物理性地包裹或吸附断裂的gDNA片段，阻碍两者的有效分离；而多酚物质在裂解液中被氧化成醌类化合物，后者能与RNA和DNA的碱基发生不可逆的共价结合，形成稳定的交联网络，使得gDNA片段被牢固地缠绕在RNA-多酚复合物中，常规的氯仿抽提或硅胶柱纯化难以将其完全解离移除。其次，细胞裂解过程中的剧烈涡旋或研磨震动会导致长链染色体DNA发生随机断裂，产生大量从几百到几千碱基对不等的DNA片段，其中部分片段大小与mRNA或核糖体RNA相近，从而提高与RNA一同被收集的概率；此外，如果裂解缓冲液的去垢剂浓度不足或离子强度不当，可能无法充分溶解核膜并完全解离染色质结构，反而会使部分gDNA以可溶的染色质片段形式释放到裂解液中，与RNA并行进入后续纯化环节。因此，建立一种快速、灵敏、可靠的方法，用于检测和评估剑麻cDNA制备物中gDNA是否残留，是确保后续所有分子实验数据准确可靠的必要质控步骤，对于剑麻功能基因组学研究及分子育种实践具有重要意义。
目前实验室中检测gDNA污染的方法存在一定的局限性：紫外分光光度法无法特异性区分gDNA与cDNA，对微量的gDNA残留不敏感；使用qPCR法对cDNA纯度进行检测需要高纯度的阴性对照和实时荧光定量PCR仪，qPCR试剂相较普通Taq酶更为昂贵；琼脂糖凝胶电泳检测cDNA质量无法观测样品中存在的痕量gDNA残留。现有技术缺乏一种能够清晰、直观、快速地鉴定剑麻cDNA中gDNA残留的专用方法。由此，提出本发明申请。
发明内容
本发明要解决的技术问题是为了克服现有的不足，本发明提供一种特异性检测剑麻cDNA中基因组DNA残留的引物及其方法和应用。
本发明的第一个目的是提供一种特异性检测gDNA污染残留的引物。
本发明的第二个目的是提供检测gDNA污染残留引物的应用。
本发明的第三个目的是提供一种检测试剂盒。
本发明的第四个目的是提供检测试剂盒的应用。
本发明的第五个目的是提供一种鉴定剑麻cDNA中基因组DNA残留的方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供一种特异性检测gDNA污染残留的引物，包括上游引物5'-CAgTggTCgTACAACTggTAT-3'和下游引物5'-ATCCTCCAATCCAgACACTgT-3'。
本发明在H.11648基因组数据中获得在剑麻各组织中稳定表达的管家基因，发现β-ACTIN基因（基因号：EVM0008077）在各个组织中均有稳定表达。通过比对β-ACTIN基因组DNA序列与cDNA序列，发现在剑麻β-ACTIN基因中存在两个长度约50-10bp内含子序列。基于这一独特的序列差异，本发明设计了一对特异性引物，其PCR产物横跨1号内含子，能够基于扩增片段长度的差异，在普通琼脂糖凝胶电泳中能对剑麻cDNA与gDNA进行明确区分（条带大小不同），并且用于不同来源和品种的剑麻中均能准确检测出gDNA污染残留。该检测引物具有特异性高、稳定性好、泛用性强、检测方法简便和经济实惠等优点。本发明提供的β-ACTIN引物能明确揭示不同提取方法下cDNA的纯度差异，为评估剑麻RNA提取质量及保障后续分子实验数据的可靠性提供了高效、特异的标准化质控工具。
因此，本发明提供特异性检测gDNA污染残留的引物在特异性检测剑麻中gDNA污染残留中的应用。
本发明提供特异性检测gDNA污染残留的引物在制备检测剑麻中gDNA污染残留、或在鉴定或区分剑麻cDNA与gDNA的产品中的应用。
本发明提供一种检测试剂盒，含上述引物。
优选地，所述试剂盒还含有PCR扩增试剂。
本发明提供上述检测试剂盒在特异性检测剑麻中gDNA污染残留、或在鉴定或区分剑麻cDNA与gDNA中的应用。
本发明提供一种鉴定剑麻cDNA中基因组DNA残留的方法，采用上述引物对剑麻cDNA进行扩增检测，若待测样本中扩增出700±25bp的条带，则说明样本中存在gDNA污染。
优选地，所述扩增检测的程序为：95℃ 3min，95℃ 10s，65℃ 20s，72℃ 5min，35个循环。
优选地，所述扩增检测的反应体系为：10μL 2×Taq-AS PCR Mix，0.5μL cDNA，上下游引物各0.25μL，加ddH2O补至总体积为20μL。
同样地，本发明采用上述引物能用于鉴定或区分剑麻cDNA与gDNA，进一步可结合测序分析区分剑麻cDNA与gDNA；具体为采用上述引物对剑麻DNA进行扩增检测，若待测样本中扩增出700±25bp的条带则为gDNA；若待测样本中扩增出600±25bp的条带则为cDNA。
本发明以剑麻β-ACTIN基因为靶点，设计的检测引物能用于特异性检测剑麻gDNA污染残留，能明确揭示不同提取方法下cDNA的纯度差异，为评估剑麻RNA提取质量及保障后续分子实验数据的可靠性提供了高效、特异的标准化质控工具。因此，采用检测剑麻β-ACTIN基因的试剂，同样能用于检测剑麻中gDNA污染残留，或在制备特异性检测剑麻中gDNA污染残留、或在鉴定或区分剑麻cDNA与gDNA的产品中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的一种特异性检测剑麻cDNA中基因组DNA残留的引物及其方法具有以下优势：
（1）周期短：采用本发明提供的引物利用PCR技术鉴定cDNA中gDNA的残留，反应灵敏，时间短，准确性高。可以在短时间内完成对样品内gDNA残留的检测。
（2）属内通用性强：本发明针对剑麻特有的β-ACTIN基因序列设计，在供试的55个剑麻品种中均能有效扩增，表现出良好的属内通用性。
（3）检测方法简便、经济实惠：采用本发明的引物和方法，通过常规PCR仪、常规Taq酶和通用PCR程序均可获得预期结果，无需依赖昂贵的荧光定量PCR仪或测序设备，且使用琼脂糖凝胶电泳较PAGE等其他电泳检测方法污染更低。
（4）填补技术空白：解决了剑麻这一重要经济作物在分子生物学研究中长期存在的cDNA质控难题，是对剑麻基因组资源的重要应用性补充。
附图说明
图1为目标序列结构示意图。
图1
图2为β-ACTIN引物对H.11648 cDNA和DNA的PCR鉴定结果（Marker为DNA D2000 Marker）。
图2
图3为β-ACTIN引物对55个品种DNA和cDNA的PCR鉴定结果（数字为样品编号，D为gDNA的简写，C为cDNA的简写，下同；Marker为DNA D2000 Marker）。
图3
图4为部分品种DNA和cDNA的PCR产物测序结果。
图4
图5为不同试剂盒提取的RNA反转录获得的剑麻cDNA PCR扩增结果。
图5
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例中采用的植物材料剑麻H.11648和55份种剑麻品种或者杂交后代均种植于中国热带农业科学院南亚热带作物研究所剑麻种质资源圃。
实施例中采用的植物总DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司（高效植物基因组DNA提取试剂盒）；植物总RNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司（DP441）和长沙信励致和科技有限公司（AB0313）；反转录试剂盒（MonScriptTMRTIII All-in-One Mix）和Taq酶（2×Taq-AS PCR Forest Mix）均购于江苏愚公生命科技有限公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（RTP2201-03）和DNA Marker（RTM415-02）购自中科瑞泰生物科技有限公司；引物合成和DNA测序由广州艾基生物技术有限公司完成。
实施例1 特异性引物设计
1、β-ACTIN基因基因结构分析及引物设计
基于本申请的前期研究，在剑麻基因组中克隆了12个内参基因，经过分析这些基因在剑麻各组织中的表达水平，评估获得了在在剑麻各组织中稳定表达的β-ACTIN基因（基因号：EVM0008077）。
基于β-ACTIN基因的基因组DNA序列和CDS序列，利用IBS（Illustrator for Biological Sequences）2.0绘制了β-ACTIN基因的内含子-外显子结构示意图，如图1所示，显示β-ACTIN基因中存在两个长度约100bp内含子序列。再利用NCBI在线工具Primer-BLAST设计了一对特异性引物，该引物上游位于外显子1末端，下游因为位于外显子2的末端，具体引物序列信息如表1所示。
表1 β-ACTIN引物列表
2、引物的扩增
使用上述设计的引物，对剑麻H.11648样本的cDNA和gDNA进行扩增检测，通过试剂盒法提取剑麻样本的gDNA，再通过TRIzol法和试剂盒法提取剑麻的RNA。然后进行cDNA反转录，反转录体系为：4μL All-in-One First-Strand Synthesis MasterMix（5×），50ng-1μg RNA，加ddH2O补至总体积为20μL。反转录程序为：55℃45min，85℃10s。进行PCR扩增的反应体系为：10μL2×Taq-AS PCR Mix，0.5μLcDNA，上下游引物各0.25μL，加ddH2O补至总体积为20μL。PCR程序为：95℃3min，95℃10s，65℃20s，72℃5min，35个循环。随后将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
检测结果如图2所示，显示扩增条带大小具有差异，该引物以剑麻H11648的基因组DNA为模版，PCR扩增产物大小为700bp；以剑麻H11648的cDNA为模版，PCR扩增产物大小为600bp，能清晰分辨剑麻H.11648样本的cDNA和gDNA。
实施例2 对不同剑麻品种的cDNA进行DNA残留检测
1、材料处理
用于鉴定的样品来自下表2中记载的55个剑麻品种的叶片。用ddH2O和75%乙醇清洗上述来源叶片表面，置于液氮中速冻，样品冻存于-80℃或者立即研磨。
表2 剑麻品种编号及名称
2、DNA和RNA提取
通过试剂盒法提取各个剑麻样本的gDNA，再通过TRIzol法和试剂盒法提取剑麻的RNA。然后进行cDNA反转录，反转录体系为：4μL All-in-One First-Strand Synthesis MasterMix（5×），50ng-1μg RNA，加ddH2O补至总体积为20μL。反转录程序为：55℃ 45min，85℃ 10s。
3、引物对不同品种来源gDNA和cDNA样品的检测结果
以收集的55份剑麻品种或者杂交后代的gDNA和cDNA为模板，利用设计的β-ACTIN引物进行PCR。PCR反应体系为：10μL 2×Taq-AS PCR Mix，0.5μL cDNA，上下游引物各0.25 μL，加ddH2O补至总体积为20μL。PCR程序为：95℃ 3min，95℃ 10s，65℃ 20s，72℃ 5min，35个循环。
利用设计的引物，对55个品种来源的DNA和cDNA进行PCR扩增。结果显示，以55份材料的gDNA为模版，扩增获得700bp左右条带；以55份材料的cDNA为模版，扩增获得600bp左右的条带，结果如图3所示。凝胶电泳结果清楚的显示以gDNA为模版的扩增的PCR产物条带大于以cDNA为模版的PCR产物条带，能够明确区分开cDNA和gDNA。
4、测序比对结果
对上述55个剑麻品种DNA和cDNA PCR产物进行测序比对分析，使用Lynnon Biosoft公司开发的DNAMAN软件对测序所得序列进行多序列比对分析，并采用英国邓迪大学计算生物学中心开发的Jalview软件对序列比对结果进行可视化呈现与人工校验。
结果显示，各剑麻品种中对应外显子1和外显子2的碱基序列高同源，而gDNA序列中对应外显子1和外显子2序列之间均存在50-100bp的内含子序列，如图4所示。综合凝胶电泳和DNA测序结果，表明该引物也适用于H11648之外的剑麻品种cDNA中基因组DNA残留的检测。
综上结果证明了该引物扩增的序列高度同源性，并具备特异性，能鉴定其DNA样本是否存在gDNA污染；而进一步结合凝胶电泳条和DNA测序结果，能区分混合污染。在DNA样本中存在gDNA残留，会影响后续基因的克隆，导致克隆的cDNA序列中含有内含子序列。因此，通过本发明提供的特异性引物能鉴定并检测gDNA是否残留。
实施例3 剑麻gDNA污染的检测
为验证β-ACTIN引物对不同方法提取的剑麻cDNA样本的质控效能，分别使用现有公司A和公司B的植物总RNA提取试剂盒，以及本领域常规Trizol法，分别提取表2中1-10号品种和15号品种共计11个剑麻品种的RNA并逆转录获得cDNA，利用β-ACTIN引物对所得cDNA进行PCR扩增，扩增方法条件同实施例1，随后进行电泳检测。
检测结果如图5所示，可见试剂盒法提取植物RNA受到gDNA污染的影响较小，表现为单一条带，但仍有少量样品存在gDNA污染；而Trizol法所提取的RNA中大部分样品存在明显gDNA污染，使用β-ACTIN引物进行PCR扩增后能清晰检测并看到在cDNA扩增条带上方存在更长的gDNA扩增条带，电泳结果显示存在双带的PCR产物，就是cDNA中存在gDNA污染的情况。基于PCR的高灵敏性，能检测到皮克（1*10-12g）级DNA，因此本发明提供的引物通过常规PCR进行检测就能用于鉴定或检测其DNA样本是否存在gDNA污染。上述结果证明本发明提供的β-ACTIN引物能明确揭示不同提取方法下cDNA的纯度差异，为评估剑麻RNA提取质量及保障后续分子实验数据的可靠性提供了高效、特异的标准化质控工具。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
文章摘自国家发明专利，一种特异性检测剑麻cDNA中基因组DNA残留的引物及其方法和应用，发明人:谌惠邦，杨子平，王淦，柯智，张燕梅，申请号：202610102960.1，申请日:2026.01.26。
