摘 要：本发明提供了一种具有降三高功能的罗布红麻提取物的制备方法，包括以下步骤：A)采用黑曲霉孢子悬液对罗布红麻进行固态发酵，得到发酵后的罗布红麻；B)将发酵后的罗布红麻依次进行醇提以及分离纯化，得到罗布红麻提取物。本发明选用黑曲霉对罗布红麻进行发酵处理，黑曲霉在发酵过程中能够产生丰富的酶类物质，一方面，这些酶类有利于壁内有效成分的提取，可以提高有效成分的物质含量，另一方面，相关的糖苷水解酶类可以水解相关的糖苷衍生物，获得具有更高药效活性的苷元类物质。同时根据分子的极性大小，利用不同极性的有机溶剂可以提纯某类生物活性物质，比如多酚、黄酮类物质，从而使各种药理活性得到显著提高。
权利要求书
1.一种具有降三高功能的罗布红麻提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A)采用黑曲霉孢子悬液对罗布红麻进行固态发酵，得到发酵后的罗布红麻；
B)将发酵后的罗布红麻依次进行醇提以及分离纯化，得到罗布红麻提取物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤B)包括以下步骤：
B1)将所述发酵后的罗布红麻干燥后研磨，得到干燥后的粉末；将所述干燥后的粉末进行乙醇醇提，得到罗布红麻醇提液；
B2)将所述罗布红麻醇提液浓缩后依次用石油醚和乙酸乙酯进行萃取，分别得到石油醚组分、乙酸乙酯组分和水组分；将所述石油醚组分、乙酸乙酯组分和水组分浓缩干燥，得到罗布红麻石油醚提取物、罗布红麻乙酸乙酯提取物以及罗布红麻水提物。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述黑曲霉悬液按照如下方法进行制备：将所述黑曲霉孢子粉溶于无菌水中，然后用脱脂棉进行过滤，得到黑曲霉孢子悬液。
4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述固态发酵的方法包括以下步骤：向灭菌后的罗布红麻中加入无菌水，再接入黑曲霉孢子悬液，进行固态发酵；所述灭菌后的罗布红麻、无菌水以及黑曲霉孢子悬液的质量体积比为(3～5)g：(5～7)mL：(2～4)mL；所述黑曲霉孢子悬液的浓度为1g：200～400mL；所述固态发酵的温度为25～30℃，时间为3～7天。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述乙醇醇提的同时进行超声；
所述醇提所用的醇为乙醇溶液，乙醇溶液的体积浓度为60％～80％，所述干燥后的粉末与乙醇溶液的质量体积比为1：10～1：20；
所述超声的功率为450～500W，时间为1～2h；
所述乙醇醇提后进行离心，收集上清液，然后将上清液进行过滤，得到罗布红麻醇提液。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤B2)中，所述浓缩为去除乙醇；
每次进行萃取时，所述罗布红麻醇提液与萃取所用的有机溶剂的体积比为1：1～1：2；所述萃取的次数为三次或三次以上。
7.一种如权利要求1～6任意一项所述的制备方法制备得到的罗布红麻提取物。
8.一种如权利要求7所述的罗布红麻提取物在制备具有降三高功效的产品中的应用。
9.一种如权利要求7所述的罗布红麻提取物在制备胰脂肪酶抑制剂、α 葡萄糖苷酶抑制剂和血管紧张素转化酶抑制剂中的应用。
10.一种如权利要求7所述的罗布红麻提取物在制备具有抗氧化功效的产品中的应用。
技术领域
本发明属于天然产物提取和医药术领域，具体涉及一种具有降三高功能的罗布红麻提取物及其制备方法以及应用。
背景技术
罗布红麻(Apocynum venetum L.)为捩花目夹竹桃科罗布红麻属直立半灌木，叶、根、茎、花、全草均可入药，属于多年生宿根草本植物，具有很强的抗逆性。从每年3月下旬开始，到4月中旬左右，罗布红麻便开始萌芽生长，在5月下旬到6月中旬期间进入开花初期，大约在8月下旬至9月中旬进入开花末期，通常情况下花期持续周期长达90天，此时种子便进入到成熟期，年生长周期大约有180天，作为药用植物被收录在《中国药典(2015版)》一部。罗布红麻因罗布泊而得名，在古代被称为“泽漆”，主要分布于中国辽宁、吉林、内蒙古、甘肃、新疆、陕西、山西等地区。《陕西中草药》载：“(罗布红麻叶)清凉泻火，强心利尿，降血压。治心脏病，高血压，神经衰弱，肾炎浮肿”。大量药理实验表明，罗布红麻活性成分对预防和治疗如高血压、高血脂、冠心病等心血管疾病以及哮喘病、气管炎等呼吸系统疾病有较好的疗效。但是，目前罗布红麻的提取方法得到的罗布红麻提取物中有效成分含量较低，功效有限。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种具有降三高功能的罗布红麻提取物的制备方法，本发明提供的方法可以显著提高罗布红麻提取物中有效成分的物质含量，从而使各种药理活性得到显著提高。
本发明提供了一种具有降三高功能的罗布红麻提取物的制备方法，包括以下步骤：
A)采用黑曲霉孢子悬液对罗布红麻进行固态发酵，得到发酵后的罗布红麻；
B)将发酵后的罗布红麻依次进行醇提以及分离纯化，得到罗布红麻提取物。
优选的，步骤B)包括以下步骤：
B1)将所述发酵后的罗布红麻干燥后研磨，得到干燥后的粉末；
将所述干燥后的粉末进行乙醇醇提，得到罗布红麻醇提液；
B2)将所述罗布红麻醇提液浓缩后依次用石油醚和乙酸乙酯进行萃取，分别得到石油醚组分、乙酸乙酯组分和水组分；
将所述石油醚组分、乙酸乙酯组分和水组分浓缩干燥，得到罗布红麻石油醚提取物、罗布红麻乙酸乙酯提取物以及罗布红麻水提物。
优选的，所述黑曲霉悬液按照如下方法进行制备：
将所述黑曲霉孢子粉溶于无菌水中，然后用脱脂棉进行过滤，得到黑曲霉孢子悬液。
优选的，所述固态发酵的方法包括以下步骤：
向灭菌后的罗布红麻中加入无菌水，再接入黑曲霉孢子悬液，进行固态发酵；
所述灭菌后的罗布红麻、无菌水以及黑曲霉孢子悬液的质量体积比为(3～5)g：(5～7)mL：(2～4)mL；
所述黑曲霉孢子悬液的浓度为1g：200～400mL；
所述固态发酵的温度为25～30℃，时间为3～7天。
优选的，所述乙醇醇提的同时进行超声；
所述醇提所用的醇为乙醇溶液，乙醇溶液的体积浓度为60％～80％，所述干燥后的粉末与乙醇溶液的质量体积比为1：10～1：20；
所述超声的功率为450～500W，时间为1～2h；
所述乙醇醇提后进行离心，收集上清液，然后将上清液进行过滤，得到罗布红麻醇提液。
优选的，步骤B2)中，所述浓缩为去除乙醇；
每次进行萃取时，所述罗布红麻醇提液与萃取所用的有机溶剂的体积比为1：1～1：2；
所述萃取的次数为三次或三次以上。
本发明还提供了一种上述制备方法制备得到的罗布红麻提取物。
本发明还提供了一种上述罗布红麻提取物在制备具有降三高功效的产品中的应用。
本发明还提供了一种上述罗布红麻提取物在制备胰脂肪酶抑制剂、α 葡萄糖苷酶抑制剂和血管紧张素转化酶抑制剂中的应用。
本发明还提供了一种上述罗布红麻提取物在制备具有抗氧化功效的产品中的应用。
与现有技术相比，本发明提供了一种具有降三高功能的罗布红麻提取物的制备方法，包括以下步骤：A)采用黑曲霉孢子悬液对罗布红麻进行固态发酵，得到发酵后的罗布红麻；B)将发酵后的罗布红麻依次进行醇提以及分离纯化，得到罗布红麻提取物。本发明选用黑曲霉对罗布红麻进行发酵处理，黑曲霉在发酵过程中能够产生丰富的酶类物质，如纤维素酶、淀粉酶、果胶酶、蛋白酶、木质素酶等，一方面，这些酶类有利于壁内有效成分的提取，可以提高有效成分的物质含量，另一方面，相关的糖苷水解酶类可以水解相关的糖苷衍生物，获得具有更高药效活性的苷元类物质。同时根据分子的极性大小，利用不同极性的有机溶剂可以提纯某类生物活性物质，比如多酚、黄酮类物质，从而使各种药理活性得到显著提高。
附图说明
图1为本发明提供的具有降三高功能的罗布红麻提取物的制备方法的工艺流程图；
图2为黑曲霉发酵6天后罗布红麻不同组分抗氧化能力比较；
图3为黑曲霉发酵前后，罗布红麻醇提物、石油醚组分、乙酸乙酯组分和水组分对胰脂肪酶的抑制活性；
图4为黑曲霉发酵6天后罗布红麻不同组分抗氧化能力比较。
具体实施方式
本发明提供了一种具有降三高功能的罗布红麻提取物的制备方法，包括以下步骤：
A)采用黑曲霉孢子悬液对罗布红麻进行固态发酵，得到发酵后的罗布红麻；
B)将发酵后的罗布红麻依次进行醇提以及分离纯化，得到罗布红麻提取物。
本发明首先制备黑曲霉孢子悬液，所述黑曲霉悬液按照如下方法进行制备：
将所述黑曲霉孢子粉溶于无菌水中，然后用脱脂棉进行过滤，得到黑曲霉孢子悬液。
其中，所述黑曲霉孢子粉与无菌水的质量体积比为1g：(200～400)mL，优选为1g：200mL、1g：300mL、1g：400mL，或1g：(200～400)mL之间的任意值。
得到黑曲霉孢子悬液后，采用黑曲霉孢子悬液对罗布红麻进行固态发酵，得到发酵后的罗布红麻。
具体的，向灭菌后的罗布红麻中加入无菌水，再接入黑曲霉孢子悬液，进行固态发酵；
其中，对所述罗布红麻进行灭菌的方法和条件并没有特殊限制，本领域技术人员公知的灭菌方法和条件即可。在本发明中，优选采用121℃，20min的灭菌条件。
所述灭菌后的罗布红麻、无菌水以及黑曲霉孢子悬液的质量体积比为(3～5)g：(5～7)mL：(2～4)mL，优选为3g：5mL：2mL，或(3～5)g：(5～7)mL：(2～4)mL之间的任意值；
所述黑曲霉孢子悬液的浓度为1g：200～400mL，优选为1g：200mL、1g：300mL、1g：400mL，或1g：(200～400)mL之间的任意值；
所述固态发酵的温度为25～30℃，优选为25、26、27、28、29、30，或25～30℃之间的任意值，时间为3～7天，优选为3、4、5、6、7，或3～7天之间的任意值。
接着，将发酵后的罗布红麻依次进行醇提以及分离纯化，得到罗布红麻提取物。
具体的，包括以下步骤：
B1)将所述发酵后的罗布红麻干燥后研磨，得到干燥后的粉末；
将所述干燥后的粉末进行乙醇醇提，得到罗布红麻醇提液；
B2)将所述罗布红麻醇提液浓缩后依次用石油醚和乙酸乙酯进行萃取，分别得到石油醚组分、乙酸乙酯组分和水组分；
将所述石油醚组分、乙酸乙酯组分和水组分浓缩干燥，得到罗布红麻石油醚提取物、罗布红麻乙酸乙酯提取物以及罗布红麻水提物。
本发明先将发酵后的罗布红麻干燥后研磨。其中，所述干燥优选为冷冻干燥，干燥后研磨成粉末，再置于烘箱中烘干至恒重。
然后，将干燥后的粉末与乙醇溶液混合进行醇提，在进行醇提的同时进行超声。
其中，所述乙醇溶液的体积浓度为60％～80％，优选为60％、65％、70％、75％、80％，或60％～80％之间的任意值，所述干燥后的粉末与乙醇溶液的质量体积比为1：10～1：20，优选为1：10、1：15、1：20，或1：10～1：20之间的任意值；
所述超声的功率为450～500W，优选为450、460、470、480、490、500，或450～500W之间的任意值，时间为1～2h；
所述乙醇醇提后进行离心，收集上清液，然后将上清液进行过滤，得到罗布红麻醇提液。
然后，将所述罗布红麻醇提液浓缩后依次用石油醚和乙酸乙酯进行萃取，分别得到石油醚组分、乙酸乙酯组分和水组分。
其中，将所述罗布红麻醇提液于旋转蒸发仪中，在50℃下将乙醇挥发掉，得到浓缩液。按照溶剂极性有小到大，依次用石油醚和乙酸乙酯萃取浓缩液，每次萃取有机溶剂与样品体积比例均为1：1～1：2，每个组分萃取重复三次或以上，依次得到石油醚组分(PE)、乙酸乙酯组分(EA)和水组分。
将所述石油醚组分、乙酸乙酯组分和水组分浓缩干燥，得到罗布红麻石油醚提取物、罗布红麻乙酸乙酯提取物以及罗布红麻水提物。
本发明对所述浓缩干燥的方法并没有特殊限制，本领域技术人员公知的方法即可。在本发明中，所述干燥优选为冷冻干燥。
参见图1，图1为本发明提供的具有降三高功能的罗布红麻提取物的制备方法的工艺流程图。
本发明还提供了一种上述制备方法制备得到的罗布红麻提取物。
本发明还提供了一种上述罗布红麻提取物在制备具有降三高功效的产品中的应用。
本发明还提供了一种上述罗布红麻提取物在制备胰脂肪酶抑制剂、α 葡萄糖苷酶抑制剂和血管紧张素转化酶抑制剂中的应用。
本发明还提供了一种上述罗布红麻提取物在制备具有抗氧化功效的产品中的应用。
本发明选用黑曲霉对罗布红麻进行发酵处理，可以有效降低一些天然产物本身固有的毒性，在发酵过程也可以酶解药材细胞壁结构，更充分的释放天然产物的有效成分，提高其利用率。微生物在发酵过程中，亦会产生次生代谢产物，其中就包括多种生物酶，可以有效的把蛋白质、多糖等生物大分子分解为分子量较小的物质，发酵后的发酵液可以提高有效成分的物质含量，从而使各种药理活性得到显著提高。此外，本发明提供的方法还具有成本低、不易致敏。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的具有降三高功能的罗布红麻提取物及其制备方法以及应用进行说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。
实施例
1.1菌种
食品级黑曲霉(中国工业微生物菌种保藏中心CICC 2339)，米曲霉(中国普通微生物菌种保存中心，CGMCC 3.7202)和红曲霉(中国农业微生物菌种保存中心，ACCC30345)。
1.2菌株纯化
将黑曲霉、米曲霉和红曲霉孢子粉分别溶于无菌水中，400mL水中加菌种1g，然后用脱脂棉过滤，除去不溶的大颗粒孢子，制备均一的孢子悬液，用于后续的固态发酵。
1.3固态发酵
采用1.2中的孢子悬液对罗布红麻(来源于新疆尉犁县)进行了固态发酵，称取灭菌(121℃，20min)好的3g罗布红麻置于一次性培养皿中，加入5mL无菌水，再接入2mL黑曲霉孢子悬液，30℃下发酵6d，其中未接入2mL孢子悬液作为对照组。
1.4.罗布红麻醇提与粗分离纯化
将1.3中的对照样与发酵样置于冷冻干燥机中，干燥1d，取出后用研钵磨成粉末，置于烘箱中50℃烘干至恒重。准确称取1g烘干后的样品粉末于50mLEP管中，加入20mL70％的乙醇溶液浸没样品，将离心管置于超声仪中，500W超声1h，8000rpm离心10min，收集上清液。样品提取液用0.45μm孔径滤膜过滤，收集的滤液即为罗布红麻醇提液。每个样品提取工序重复3次。
1.5罗布红麻醇提液的粗分离纯化
将步骤1.4中的醇提液于旋转蒸发仪中，在50℃下将乙醇挥发掉，得到浓缩液。按照溶剂极性有小到大，依次用石油醚和乙酸乙酯萃取浓缩液，每次萃取有机溶剂与样品比例均为1：1，每个组分萃取重复三次或以上，依次得到石油醚组分(PE)、乙酸乙酯组分(EA)和水组分。
1.6固体样品制备
将步骤1.5中各组分用旋转蒸发仪浓缩至相应溶剂至1 2mL(其中除了水组分在60℃下旋蒸外，其余温度均为50℃)。将剩余的浓缩液收集至10mLEP管中，其中粗提物和水组分于 80℃下预先冻存。将冻好的固体于冷冻干燥机中2 3d，得到相应组分的冻干粉，后置于烘箱中烘干至恒重。而石油醚组分和乙酸乙酯组分与烘箱中挥发干净至恒重即可。
1.7样品复溶
用DMSO溶解1.6中各组分固体至浓度为10mg/mL，稀释至一定浓度梯度用于后续功效的评价，其中浓度1mg/mL分别用于胰脂肪酶抑制、α 葡萄糖苷酶抑制和血管紧张素转化酶抑制实验。
1.8降三高实验方案
1.8.1α 糖苷酶抑制率
(1)试剂准备
0.1mol/LNa2CO3：称量2.1198gNa2CO3固体溶于200mL蒸馏水中；
25mMpH＝6.9PBS：称量4.477g十二水合磷酸氢二钠和1.95g二水合磷酸二氢钠分别溶于500mL蒸馏水中，混匀后将ph调节至6.9；
1×10 3mg/mLα glucosidase(sigma)：先称量1mg/mL的酶，再逐步进行稀释；(低温保存)
5mmol/Lp NPG溶液：称量0.151g对硝基苯 α D 吡喃葡萄糖苷(索莱宝)溶于100mLPBS中，混匀。
对硝基苯 α D 吡喃葡萄糖苷：α 葡萄糖苷酶的底物；
(2)具体实验过程
将0.2mL的样品与1mL的1×10 3mg/mL的α 葡萄糖苷酶溶液于37℃水浴中混合反应10min，再加入0.5mL5mmol/L的p NPG溶液于37℃水浴中混合反应10min，后加入0.1mol/L的Na2CO3(1mL)溶液终止反应，在405nm处的吸光度进行测定。按下列公式计算α 葡萄糖苷酶抑制率。
阳性对照：阿卡波糖
其中，所用的样品为采用黑曲霉发酵后的罗布红麻醇提物、石油醚组分、乙酸乙酯组分以及水组分，以及未进行黑曲霉发酵的罗布红麻直接进行醇提的醇提物、石油醚组分、乙酸乙酯组分和水组分。
抑制率(％)＝[1 (A4 A3)/(A2 A1)]×100％
对照背景组A1：底物(p NPG)
对照组A2：酶和底物(p NPG)
实验背景组A3：样品+底物(p NPG)
实验组A4：实验组
总体系为2.7mL，不足的加入PBS配平。具体组成参见表1
表1
(3)实验结果
参见图2，图2为黑曲霉发酵前后，罗布红麻醇提物、石油醚组分、乙酸乙酯组分和水组分对α 葡萄糖苷酶抑制活性。由图2可知，在1mg/mL样品浓度下，罗布红麻醇提物的石油醚组分、乙酸乙酯组分和水组分的α 葡萄糖苷酶抑制活性分别为55.45％、97.48％和61.27％。经黑曲霉发酵后，罗布红麻醇提物的石油醚组分和水组分的抑制活性分别显著提高了29.64％和16.00％。而与未发酵组相比，乙酸乙酯组分经发酵后对α 葡萄糖苷酶的抑制作用没有明显变化。
1.8.2胰脂肪酶抑制率
(1)试剂准备
4 硝基苯丁酸酯(p NPB)购自麦克林
猪胰脂肪酶购自索莱宝
十二水合磷酸氢二钠购自湖南汇虹试剂有限公司
二水合磷酸二氢钠购自湖南汇虹试剂有限公司
(2)试剂配制：
25mMpH＝7.4PBS：称量4.477g十二水合磷酸氢二钠和1.95g二水合磷酸二氢钠分别溶于500mL蒸馏水中，混匀后将pH调节至7.4；
5mg/mL胰脂肪酶：称取50mg的胰脂肪酶溶于50mL的无菌水中，然后8000r离心5min，弃沉淀取上清，酶置于冰盒中使用；
11.2mol/Lp NPB溶液的配制：用移液枪吸取0.11715gp NPB溶液溶于50mLPBS中，置于冰盒中备用
(3)实验过程
将50μL样品、50μL胰脂肪酶、50μLPBS混合，并置于37℃水浴锅中孵育10min，再加入50μLp NPB溶液，轻轻震荡混匀，置于37℃水浴锅中孵育20min，于405nm波长测定吸光度并记录数值。
其中，所用的样品为采用黑曲霉发酵后的罗布红麻醇提物、石油醚组分、乙酸乙酯组分以及水组分，以及未经黑曲霉发酵的罗布红麻直接进行醇提的醇提物、石油醚组分、乙酸乙酯组分和水组分。
抑制率(％)＝[1 (A4 A3)/(A2 A1)]×100％
对照背景组A1：底物(p NPB)
对照组A2：酶和底物(p NPB)
实验背景组A3：样品+底物(p NPB)
实验组A4：实验组
总体系为200μL，不足的加入PBS配平。具体组成参见表2
表2
(4)实验结果
参见图3，图3为黑曲霉发酵前后，罗布红麻醇提物、石油醚组分、乙酸乙酯组分和水组分对胰脂肪酶的抑制活性。由图3可知，在1mg/mL样品浓度下，罗布红麻醇提物的石油醚组分、乙酸乙酯组分和水组分对胰腺脂肪酶抑制活性分别为4％、26％和2％。黑曲霉发酵可提高各组分对胰腺脂肪酶抑制活性。黑曲霉发酵6天后，罗布红麻醇提物的乙酸乙酯组分的胰脂肪酶抑制活性增加了28％。
1.9抗氧化实验
(1)实验方法
一、羟自由基清除能力的测定
1.试剂
(1)FeSO4溶液：称0.1668g绿矾用少量纯水溶解，并定容在100mL容量瓶中，备用，最好避光保存。
(2)H2O2溶液：量取30％的H2O2溶液0.6mL，加水定容至1L。(注：30％表示质量分数)
(3)称0.0828g水杨酸用少量无水乙醇溶解，并定容到100mL容量瓶中，备用。
2.步骤
实验组：
(1)向其中依次加入6mmol/L的硫酸亚铁2mL，6mmol/L样品2mL和6mmol/L的过氧化氢2mL；
(2)加入完成后震荡摇匀，静置10min；
(3)10min后加入6mmol/L的水杨酸溶液；
(4)加入后，振荡摇匀，静置30min。
其中，所用的样品为采用黑曲霉发酵后的罗布红麻醇提物、石油醚组分、乙酸乙酯组分以及水组分，以及未经黑曲霉发酵的罗布红麻直接进行醇提的醇提物、石油醚组分、乙酸乙酯组分和水组分。
对照组：将实验组第一步中加入的样品溶液使用等量的蒸馏水替代，其他条件不改变.
3.测定
在510nm光度下测量吸光度，实验组为AX，对照组为A0
4.羟自由基清除率＝1 AX/A0
二、总还原力
1.试剂
(1)pH＝6.60.2mol/L的PBS缓冲液：
A液：0.2mol/L，磷酸二氢钠(NaH2PO)，称取6.24g的二水磷酸二氢钠(M＝156.01g/mol)溶解于200mL蒸馏水中；
B液：0.2mol/L磷酸氢二钠(Na2HPO4)，称取14.32g磷酸氢二钠(M＝358.14g/mol)溶解于200mL蒸馏水中。
取62.5mL的A液与37.5mL的B液混合即可。或者取2.685g十二水磷酸氢二钠，1.95g二水磷酸二氢钠，直接溶解在100mL纯水中。
(注：PBS易变质，应灭菌，灭菌后应该分瓶保存，开封后使用时间不应超过一周可以灭菌，也可以不灭)
(2)1％的铁氰化钾溶液：1g铁氰化钾用纯水溶解并定容至100mL。
(3)0.1％的三氯化铁溶液：0.1g的三氯化铁用纯水溶解并定容至100mL。
(4)10％的三氯乙酸：称10g三氯乙酸固体用纯水溶解并定容至100mL。
2.过程
实验组：
提前打开水浴锅调至50℃备用
(1)移取1mL样品于10mLEP管中；
(2)随即快速加入2.5mL0.2mL/L的PBS溶液和2.5mL1％的铁氰化钾溶液；
(3)混匀后于50℃水浴锅中保温20min；
(4)取出后，加入2.5mL10％的三氯乙酸溶液；
(5)加入三氯乙酸后若产生沉淀，则室温下3500r/min离心10min，吸取2.5mL的上清液，加入2.5mL蒸馏水；若加入三氯乙酸后无沉淀产生，吸取2.5mL溶液后加入2.5mL蒸馏水；
(6)加入0.5mL0.1％的三氯化铁溶液，混匀后反应10min。
其中，所用的样品为采用黑曲霉发酵的醇提物、石油醚组分、乙酸乙酯组分以及水组分，以及未经黑曲霉发酵的罗布红麻直接进行醇提的醇提物、石油醚组分、乙酸乙酯组分和水组分。
3.处理
在700nm光度下测定吸光值，实验组与对照组的吸光度大小与还原力成正比。
三、ABTS自由基清除能力
1.试剂：7.4mmol/LABTS：取ABTS3mg加蒸馏水0.735mL(M＝548.7g/mol)；2.6mmol/LK2S2O8，取K2S2O81mg，加蒸馏水1.43mL(M＝270.32g/mol)。
2.步骤
取7.4mmol/LABTS0.2mL与2.6mmol/LK2S2O80.2mL混合，在室温条件黑暗处反应12小时。反应完成后用体积分数95％的乙醇稀释40～50倍，使得混合液在735nm光度下吸收值处于0.68 0.72间即可使用(工作液)。
实验组：取0.8mL稀释后的工作液于2mLEP管中，加入样品溶液0.2mL，摇匀后静置反应6min.6min后在734nm波长下测定吸光值A。
对照组：取0.8mL稀释后的工作液于2mLEP管中，加入95％乙醇0.2mL，摇匀后静置反应6min.6min后在734nm波长下测定吸光值A0。
3.处理
清除率＝1 A/A0
四、DPPH自由基的清除率
1、试剂
(1)0.2mmol/L的DPPH(1，1 二苯基 2 三硝基苯肼)，M＝394.32g/mol，取78.864mgDPPH用无水乙醇定容至100mL，得到2mmol/L的母液，后根据需要继续用乙醇稀释10倍。
2、步骤
(1)实验组
在2mLEP管中加入1mL0.2mmol/L的DPPH+1mL样品溶液，室温下静置30min后，在517nm波长下测定吸光度.得到吸光度Ai.
在2mLEP管中加入1mL0.2mmol/L的无水乙醇和1mL样品溶液，室温下静置30min后，在517nm波长下测定吸光度.得到吸光度Aj.
(2)对照组
在2mLEP管中加入1mL0.2mmol/L的DPPH和1mL无水乙醇，室温下静置30min后，在517nm波长下测定吸光度.得到吸光度A0。
3、处理
DPPH清除率＝1 (Ai Aj)/A0
(2)实验结果
实验结果参见表2、表3和图4。图4为黑曲霉发酵6天后罗布红麻不同组分抗氧化能力比较。
表2不同菌株发酵罗布红麻后总多酚和总黄酮含量的变化情况
表3黑曲霉发酵罗布红麻不同时期后总多酚和总黄酮含量的变化情况
选择合适的微生物是罗布红麻发酵的关键步骤。通过测定总多酚和总黄酮含量，研究了不同真菌对罗布红麻发酵的影响。本研究采用米曲霉、黑曲霉和红曲酶发酵罗布红麻，发酵时间为6天。从表2可以看出，黑曲霉发酵后的总多酚(1.67mg/mL)和总黄酮(0.44mg/mL)均最高。因此，选择了黑曲霉作为后续实验的最佳发酵真菌。
为了确定黑曲霉发酵罗布红麻最佳时间，对黑曲霉发酵罗布红麻3、6、9和12天进行了取样测定总多酚和总黄酮含量。表3显示，总多酚和总黄酮含量随着发酵时间的延长而逐渐增加。第6天，黑曲霉处理的总多酚和总黄酮含量分别为1.47mg/mL和0.46mg/mL。超过6天后，总多酚和总黄酮含量略有下降。因此，最佳发酵时间为第6天。
本研究采用DPPH、ABTS+、羟基自由基清除活性和总还原能力，测定了发酵前和发酵后的罗布红麻中醇提物、石油醚提取物、乙酸乙酯提取物以及水提物的总抗氧化活性。
发酵前和发酵后罗布红麻不同组分对ABTS自由基清除率如图4A所示。在发酵前的罗布红麻各组分中，乙酸乙酯提取物组分的ABTS+自由基清除活性最高(100μg/mL为87.81％)，其次是水提物组分(100μg/mL为24.44％)。石油醚提取物组分的ABTS+自由基清除活性最低(100μg/mL时为5.28％)。与天然罗布红麻提取物相比，发酵后乙醇提取物的ABTS+自由基清除率显著提高了24.53％。
如图4B所示，发酵前的罗布红麻各个提取物组分对DPPH自由基的清除活性为：乙酸乙酯提取物(92.67％)>水提物(37.88％)>石油醚提取物(17.89％)，用黑曲霉发酵也增加了这四种亚组分的DPPH自由基清除率。
如图4C所示，发酵前的罗布红麻中的水提物组分的羟自由基清除活性最高(样品浓度为1mg/mL时为44.53％)，其次是乙酸乙酯提取物组分的前羟自由基清除活性(9.28％)。石油醚组分清除率最低(3.76％)。与天然的罗布红麻相比，发酵后乙酸乙酯组分的羟自由基清除活性也提高了56.27％。
从图4D可以看出，乙酸乙酯组分的总还原力最高(OD700value＝0.6501±0.012)，其次是水提物组分(OD700value＝0.6031±0.011)。此外，对于极性最低的石油醚提取物，它的铁还原能力非常低(OD700value＝0.5412±0.018)。发酵降低了罗布红麻乙醇提取物和石油醚组分的总还原力。然而，与发酵组相比，乙酸乙酯组分和水提物组分的总还原力没有明显变化。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
摘自国家发明专利，发明人：谢纯良，彭源德，朱作华，龚文兵，周映君，严理，胡镇修，申请号：202310168142.8，申请日：2023.02.10
