摘  要：汉麻花叶用乙醇浸泡提取后的残渣经过水提醇沉后，得到汉麻多糖-I，水相浓缩至小体积用乙酸乙酯萃取后，水层直接减压浓缩得到汉麻多糖-II，乙酸乙酯萃取后的水层继续用正丁醇萃取，减压浓缩得到汉麻多糖-III。用苯酚-硫酸法对3种汉麻多糖进行多糖质量分数的测定，并进行DPPH、ABTS、羟基、超氧阴离子自由基清除实验，结果表明，3种汉麻多糖对DPPH清除率和ABTS清除率都有良好的效果，汉麻多糖-II抗氧化活性最强，清除DPPH、ABTS、羟基、超氧阴离子自由基率的IC₅₀分别为0.012，0.043，0.138，1.857mg/mL。 

关键词：汉麻花叶；多糖；抗氧化 

汉麻（Cannabis sativa L.）为桑科大麻属一年生草本植物，又被称为火麻、寒麻、线麻和魁麻等^[1]。致幻成分四氢大麻酚（THC）含量＜0.3%的非毒品利用价值的汉麻可以被大规模种植及加工利用^[2]。汉麻的纤维、籽粒、秆芯、花、叶和根一般都是纺织、食品和医药等领域的重要来源。近几年，我国汉麻产业发展十分迅速，年产量平均增长25%^[3]。现代药理学研究表明，汉麻具有抗癫痫、抗抑郁及抗氧化等生物活性^[4]。但根据现有的汉麻提取加工技术，加工后残余物中含有大量的汉麻多糖^[5]，据报道汉麻多糖具有抗氧化、保湿、抑菌^[6]等多种功效。因此，开发一种可以合理利用汉麻花叶残渣，实现资源高值化回收利用的方法具有重要意义。 1  实验部分

 

1.1 材料与仪器

乙酸乙酯、正丁醇、无水乙醇、过氧化氢、邻苯三酚、硫酸亚铁均为分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；水杨酸、抗坏血酸均为分析纯，阿拉丁试剂（上海）有限公司；DPPH（1，1-二苯基-2-苦肼基>97.0%）、ABTS（2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐>98.0%），梯希爱（上海）化成工业发展有限公司。汉麻花叶由齐齐哈尔市塔哈乡大马岗村提供，采集后切碎晾干保存。SpectraMaxD3/iD5多功能酶标仪，美谷分子仪器（上海）有限公司。 

1.2 提取物的制备

取30.0kg干燥的汉麻花叶，加120.0L乙醇室温浸泡3d后过滤，重复2次，得到滤渣。取干燥后的滤渣5.0kg，加入50.0L水，100℃加热提取1h后过滤，重复2次，合并提取液并减压浓缩至5.0L。常温下向浓缩液中加入15.0L 95%乙醇，搅拌后放置沉淀12h后抽滤，得滤饼和滤液。滤饼为汉麻多糖-I。将滤液减压浓缩至5.0L，每次用5.0L乙酸乙酯萃取2次，取水层3.0L减压浓缩至恒重得到乙酸乙酯萃取后的水溶物（汉麻多糖-II），剩余的2.0L滤液每次用2.0L正丁醇萃取2次，将得到的水层减压浓缩至恒重，得到正丁醇萃取后的水溶物（汉麻多糖-III）。

 

1.3 多糖质量分数的测定

1.3.1 标准曲线的测定

根据文献^[7]，将配制好的0.10mg/mL葡萄糖标准溶液，用蒸馏水稀释为0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.06，0.07，0.08，0.09，0.10mg/mL的溶液，并标记离心管编号1～10，分别在每支离心管中加入5%苯酚和浓硫酸，然后将离心管放入沸水煮30min后取出，分别从每支离心管中取2.0mL加入比色皿。最后，空白对照为同样处理后的蒸馏水，标记为0，用紫外分光光度计，在490nm处测定样品的吸光度，并绘制葡萄糖标准曲线。

 

1.3.2 多糖质量分数测定

分别取3种汉麻多糖配制成0.10mg/mL样品溶液。按照标准曲线测定方法加入5%苯酚和浓硫酸，煮沸后，在490nm处测定其吸光度，进行3次平行实验，将所得的吸光度代入葡萄糖标准曲线方程，计算出3种汉麻多糖中多糖质量浓度ρ，计算3种汉麻多糖质量分数

多糖质量分数=（1）

式中：ρ为3种样品中多糖质量浓度；V为3种样品体积（mL）；m为3种样品质量（mg）。

 

1.4 抗氧化活性测试

1.4.1 DPPH自由基清除率

根据文献^[8]，分别取3种汉麻多糖配制成10.00mg/mL样品溶液，稀释浓度为0.01，0.025，0.05，0.10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00mg/mL，从稀释后的3种样品溶液与提前配制好的DPPH乙醇溶液等比例混合后在28℃避光反应30min。在517nm处测定样品的吸光度A₁；对照组是以无水乙醇代替DPPH溶液，测定相应的吸光度A₂；空白组是以无水乙醇代替样品溶液，测定相应的吸光度A₀。V_c作为阳性对照，按上述方法测定DPPH自由基清除率。 1.4.2 ABTS自由基清除率

根据文献^[9]，分别取3种汉麻多糖配制成10.00mg/mL样品溶液，进行稀释（与1.4.1一致），精确量取稀释后的3种样品溶液0.8mL，加入提前配制好的ABTS乙醇溶液3.2mL，混合均匀后在25℃下避光反应10min。在734nm处测定样品的吸光度A₁；对照组是精确量取稀释后的样品溶液0.8mL与3.2mL无水乙醇混合，测定相应的吸光度A₂；空白组是ABTS乙醇溶液与无水乙醇等比例混合，测定相应的吸光度A₀。V_c作为阳性对照，按上述方法测定ABTS自由基清除率。

 

1.4.3 羟基自由基清除率

根据文献^[10-11]，分别取3种汉麻多糖配制成10.00mg/mL样品溶液，进行稀释（与1.4.1一致），精确量取稀释后的样品溶液、9mmol/L水杨酸乙醇溶液和9mmol/L硫酸亚铁溶液各0.5mL，混合均匀，加入8.8mmol/L双氧水溶液0.5mL，在37℃下反应30min。在510nm处测定样品的吸光度A₁；对照组用等体积去离子水代替双氧水溶液，测定相应的吸光度A₂；空白组用等体积去离子水代替样品溶液，测定相应的吸光度A₀。V_c作为阳性对照，按上述方法测定羟基自由基清除率。

 

1.4.4 超氧阴离子自由基清除率

根据文献^[12-13]，分别取3种汉麻多糖配制成10.00mg/mL样品溶液，进行稀释，（与1.4.1一致），在25℃的水浴锅中预热配制好的Tris-HCl缓冲液20min。取预热后的Tris-HCl缓冲液4.5mL，再加入稀释后的样品溶液各1.0mL和25mmol/L邻苯三酚溶液0.4mL。混合后的溶液在25℃水浴中反应4min，然后加入8%盐酸溶液1.0mL终止反应，在320nm处测定样品的吸光度A₁；对照组用去离子水代替邻苯三酚溶液，测定相应的吸光度A₂；空白组用去离子水代替样品溶液，测定相应的吸光度A₀。V_c作为阳性对照，按上述方法测定超氧阴离子自由基清除率。

 

1.4.5 自由基清除率和 IC₅₀值的计算

DPPH、ABTS、羟基、超氧阴离子自由基清除率计算公式为

清除率=（2）

式中：A₀为空白组吸光度值；A₁为样品组吸光度值；A₂为对照组吸光度值。

采用IBM SPSS Statistics对各浓度所对应的清除率进行分析计算，得出不同自由基清除率的IC₅₀值。

 2  结果与讨论

 

2.1 葡萄糖标准曲线

通过苯酚-硫酸法测得葡萄糖的吸光度，结果如表1所示。以葡萄糖浓度为x轴，吸光度为y轴，绘制葡萄糖标准曲线，得回归方程y=16.0809x+0.04514，相关系数为R²=0.999，表明两者存在较好的线性关系。

表1 葡萄糖标准溶液浓度与吸光度测定数值表

  

 2.2 3种汉麻多糖的质量分数

对3种汉麻多糖中多糖质量分数的测定结果如表2所示。由表2可以看出，乙酸乙酯萃取后的水层（汉麻多糖-II）中多糖质量分数最高，其次是正丁醇萃取后的水层（汉麻多糖-III）和汉麻醇沉产物（汉麻多糖-I）。

表2 3种汉麻多糖质量分数

  

 

2.3 多糖对DPPH自由基的清除能力

以V_c为对照，测定3种汉麻多糖对DPPH的清除能力，并计算IC₅₀值，结果如表3所示。由表3可知，3种汉麻多糖对DPPH都具有一定的清除能力，其IC50值从大到小依次为：汉麻多糖-II>V_c>汉麻多糖-III>汉麻多糖-I。其中，汉麻多糖-II在1.00mg/mL浓度下对DPPH的清除能力达到90.82%，小于阳性对照Vc。

表3 3种汉麻多糖对DPPH自由基清除率的IC₅₀值

 

 

2.4 多糖对ABTS自由基的清除能力

以V_c为对照，测定3种汉麻多糖对ABTS自由基的清除能力，并计算IC₅₀值，结果如表4所示。由表4可知，3种汉麻多糖对ABTS自由基的清除能力从大到小依次为：V_c>汉麻多糖-II>汉麻多糖-III>汉麻多糖-I。其中，汉麻多糖-II在1.00mg/mL浓度下的清除率达到99.34%，仅次于阳性对照V_c。

表4 3种汉麻多糖对ABTS自由基清除率的IC₅₀值

  

 

2.5 多糖对羟基自由基的清除能力

以V_c为对照，测定3种汉麻多糖对羟基自由基的清除能力，并计算IC₅₀值，结果如表5所示。3种汉麻多糖对羟基自由基都具有一定的清除能力，3种汉麻多糖对羟基自由基清除能力的IC₅₀值，从大到小依次为：V_c>汉麻多糖-II>汉麻多糖-III>汉麻多糖-I。其中，汉麻多糖-II在1.00mg/mL浓度下的清除率达到74.52%。

表5 3种汉麻多糖对羟基自由基清除率的IC₅₀值

  

 

2.6 多糖对超氧阴离子自由基的清除能力

以V_c为对照，测定3种汉麻多糖对超氧阴离子自由基的清除能力，并计算IC₅₀值，结果如表6所示。3种汉麻多糖对超氧阴离子自由基清除能力从大到小依次为：V_c>汉麻多糖-II>汉麻多糖-III>汉麻多糖-I。其中，汉麻多糖-II在1.00mg/mL浓度下的清除率达到35.18%，小于阳性对照V_c。另外，与前3种相比，3种汉麻多糖对超氧阴离子自由基清除能力均较弱。

表6 3种汉麻多糖对超氧阴离子自由基清除率的IC₅₀值

   

 

3 结论

通过苯酚-硫酸法对3种汉麻多糖进行多糖质量分数的测定，其中，汉麻多糖-II的质量分数最高，为16.10%。对3种汉麻多糖进行DPPH、ABTS、羟基、超氧阴离子自由基清除实验，3种汉麻多糖对DPPH和ABTS清除率都有良好的效果，它们的活性顺序为：汉麻多糖-II>汉麻多糖-III>汉麻多糖-I，其中，汉麻多糖-II抗氧化活性最强。利用该特性，可将汉麻多糖应用于化妆品和饲料等相关领域。

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文章摘自：刘东辉，程亮，赵英楠，孙立秋，王丹，李军，时志春，霍金海，赵明，张树军. 汉麻多糖的提取及抗氧化活性研究[J]. 齐齐哈尔大学学报（自然科学版）. 2024，40(01)：51-55.