摘 要:以工业大麻花叶为原料，采用超声波辅助橄榄油提取大麻二酚(CBD)，利用中心组合(CCD)方法对提取工艺的4种因素进行优化。实验结果表明，最佳提取条件为:超声波功率95W、提取温度62℃、提取时间45min、料液比1:9(g/mL)，该条件下CBD浓度为39.01μg/mL，提取率达到91.35%，此结果为CBD的多元化开发应用奠定了技术基础。
关键词:工业大麻；大麻二酚；橄榄油；响应面法
引言
大麻素是含有C21结构的萜酚类化合物，是工业大麻的主要活性成分，能够与人体中枢神经系统CB1和CB2受体结合，具有抗癫痫、抗炎、抗焦虑、抗氧化和神经调节等作用［1］。2020年7月，美国食品药品监督管理局批准了大麻二酚(CBD)药物Epidiolex，用于治疗儿童结节性硬化复合物(TSC)相关的癫痫疾病，故CBD成为大麻素成分的研究热点。工业大麻中四氢大麻酚酸(THCA)和四氢大麻酚(THC)含量非常低［2］，由工业大麻花叶提取制备的产品不含或含有极低的THC但富含CBD。CBD有益作用在制药、化妆品、营养和食品工业领域获得了极大的关注，使其成为天然添加剂的重要来源［3］。
橄榄油是一种营养丰富的天然食用油，含有多种不饱和脂肪酸和蛋白质，利用CBD的亲脂性使橄榄油中富含CBD成分有助于其整体有益作用的提升［4－5］。目前，橄榄油提取CBD工艺还没有达到最优化，通常利用加热浸渍回流方法提取，具有时间长、效率低和操作复杂的缺点［6－7］，而长时间高温条件下可造成橄榄油挥发性有益成分损失。超声波辅助提取是一种低成本且快速的提取技术，是改善浸渍提取工艺的最佳选择［8］。本研究通过中心组合(CCD)方法阐明4种提取因素的显著性，建立最佳提取条件并对实验结果进行验证。
1材料和方法
1.1材料与试剂
收获工业大麻顶端30cm花叶，水洗除杂后在110℃条件下脱羧1h，使CBDA脱羧转化成CBD。脱羧原料粉碎后过60目样品筛，低温保存待用。实验样本为5～20g，取自5kg的实验室样本材料。为了确定所使用的样本是原始实验样本的真实等分，随机选择10个假定等分样本进行含量测试，CBD含量为3.3%，THC含量小于0.2%(符合法律要求)，相对标准差(RSD)＜10%。实验结果表明，样本是真正的等分，测试的CBD和THC含量是可靠的基础数值。橄榄油(食品级)购买于超市。甲醇、乙腈和甲酸均为色谱级，百灵威科技有限公司生产;CBD、CBDA、THCA和THC标准溶液均为1mg/mL，Cerilliant试剂公司生产;其他试剂为常规市售化学试剂。
1.2主要仪器与设备
液相色谱仪(LC－15C)(岛津仪器(苏州)有限公司生产)，万分之一天平(PB203-N)(梅特勒－托利多仪器(上海)有限公司生产)，超声振荡器(KQ3200DE)(昆山市超声仪器有限公司生产)，台式高速冷冻离心机(Allegra64R)(美国贝克曼库尔特有限公司生产)，立式鼓风烘箱(DHG-9035AE)(上海捷呈实验仪器有限公司生产)，全自动柱膜通用固相萃取仪(SepathsUP)(莱伯泰科仪器股份有限公司生产)。
1.3提取方法
1.3.1超声波辅助提取CBD方法
橄榄油体积120mL、提取时间15～75min、提取温度35℃~75℃,样品质量5～20g，超声波功率30~150W，超声波频率40kHz。
1.3.2常规浸渍回流提取CBD方法
称取5g样品放置于250mL三口圆底烧瓶中，连接回流冷凝器，加入120mL橄榄油，搅拌作用下使样品完全分散浸湿。100℃条件下加热120min，从t0(到达100℃的时间)开始，间隔15min取样100μL用于液相色谱分析。
1.3.3CBD含量分析方法
称取0.1g提取后橄榄油，用5mL色谱级甲醇充分涡旋混合后超声震荡30min离心分离，合并3次提取液定容至25mL，移取2mL溶液过0.22μm滤膜，在－18℃条件下保存待测。高压液相色谱(HPLC)色谱条件:InertsoilODS-3色谱柱150×4.6mm，3μm，等度洗脱。流动相:乙腈/水=75∶25(V∶V)。流动相中，甲酸含量0.1%，紫外检测波长230nm，柱温30℃,进样量10μL，流速0.7mL/min。定量计算方法:外标法，在0.06～100μg制备外标曲线。CBD标准曲线方程为y=54070x－25417(R2=0.9998)。每个样品测试3次，RSD＜10%。定量计算如表1所示，对同一天内的提取样品完成含量测试。
表1 CBD定量计算依据
1.3.4CBD提取率计算
提取率为含量百分比(%)，计算方法如式(1)所示。
提取率(%)
1.3.5响应面优化试验
根据中心组合(CCD)方法设计试验，以功率(X1)、温度(X2)、液料比(X3)和时间(X4)为自变量，以响应变量(Y)CBD浓度(μg/mL)为目标进行优化。模型参数根据单因素试验设定，如表2所示。模型建立和实验设计均使用Design-Expert13处理，设计30组试验。
表2 CBD提取因素自变量实验设计
注:α=2。
通过响应面法得到的二阶多项式模型方程对响应变量进行拟合，如式(2)所示。
其中，Y为CBD含量的响应变量，Xi、Xj为独立因子，β0、βi、βij为模型的回归系数。
1.3.6模型验证
通过计算最优超声波辅助提取条件的相对误差对提取模型进行验证，相对误差计算如式(3)所示。
1.3.7统计分析与评价
采用Design-Expert13软件进行优化和统计分析。采用方差分析(ANOVA)检验评估回归方程中统计项的显著性。采用SPSS27.0的多重比较检验来评估实验平均值之间的显著性差异，P值＜0.05和＜0.001被认为具有统计学意义和高度显著性。
2结果与分析
2.1模型拟合
采用响应面法对提取工艺进行优化，最大限度地提高橄榄油中的CBD浓度，实际试验进行3d，数据结果没有差异。自变量功率、温度、时间和液料比对响应变量影响分析如表3所示。根据这些实验数据计算多项式方程系数，用于预测CBD浓度，响应变量的回归方程为:CBD=34.15+2.55X1+2.58X2-6.85X3+0.8783X4+0.04X1X2+1.87X3X4-5.26X12-0.7137X22-3.64X32-3.75X42。此外，所有测试数据具有较低的RSD(＜4%)，平均值变化较低且实验数据与预测值接近，表明模型可以有效地用于实验设计。
表3 实验获得的橄榄油中CBD浓度
方差分析结果如表4所示，CBD的测定系数(R2)和调整测定系数(Radj)分别为0.9821和0.9654，R2和Radj值接近且≈1，表明模型很好地拟合了实验值［9］。
此外，失拟误差P值也是不显著的。结果表明，二阶多项式数学模型能很好地反映CBD的提取浓度，该拟合模型具有良好的实用性。F值分析比较可知，影响萃取率大小的因素依次为:X3＞X2＞X1＞X4。通过P值分析可知，X1、X2、X3、X1X3、X3X4、X12、X32、X42对CBD浓度有极显著影响(P＜0.0001)。
2.2响应面分析
根据影响因素交互显著性分析绘制了功率vs料液比和料液比vs时间响应面和二维等高线图。生物活性成分在溶剂中溶解是一个物理过程，无论哪种提取方法都是基于增加目标化合物与溶剂接触，从而提高目标化合物的提取率。超声辅助提取是基于空化效应提高溶剂渗入植物组织或溶质扩散到提取介质的能力［10］。实验结果表明，在60～120W，CBD浓度随着超声波功率增加而提高，对提高CBD浓度是显著的，如图1所示。提高功率可使更多溶剂渗透到细胞内促进生物活性成分接触，有利于获取更多的生物活性成分。溶质和溶剂之间浓度差也是影响提取效率的重要因素，高浓度差通过增加植物组织和溶剂主体之间浓度梯度促进提取效率提高，这也是传质过程中的驱动力，高浓度差可以得到更高的提取率和浓度。如图2所示，随着料液比增加，高浓度差促进提取效率的提高。当液料比大于9.0时，CBD浓度呈下降趋势，由于提取体系中溶剂流动性的提高，表面结合作用影响显著增加。
表4 超声波辅助提取条件回归模型方程对CBD含量方差分析
注:P＜0.05用*表示，P＜0.01用＊＊表示，P＜0.0001用＊＊＊表示。
图1 功率X1和液料比X3对CBD浓度的影响
图2液料比X3和提取时间X4对CBD提取浓度的影响
2.3提取条件验证
确定的最优提取条件为超声波功率95W、温度62℃、提取时间45min、液料比1∶9。验证提取条件，在最优条件下进行验证实验(n=6)，实验平均值为39.01±3.15μg/mL，预测值为39.13μg/mL，实验值与预测值之间差异较小，证明实验模型具有良好的预测性能，优化提取工艺可应用于更大规模的工业生产中。
2.4与常规方法比较
将最优超声波辅助提取条件与常规浸渍提取进行比较。如表5所示，超声波辅助提取方法显著提高了CBD的提取效率。
表5 与常规提取方法比较
3结论
以橄榄油为提取溶剂，通过响应面方法考察了超声波辅助提取4种因素对CBD提取效率的影响。与常规浸渍回流提取方法相比，超声波辅助方法显著提高了CBD的提取效率。响应面优化提取模型预测值与真实值具有一致性，表明提取模型具有良好的实用性，可以用来预测设定试验因素条件下橄榄油提取CBD工艺参数的响应值，该研究结果可为橄榄油提取CBD工业化应用提供理论基础。
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文章摘自：高宝昌,石雨,田媛,等.超声波辅助橄榄油提取大麻二酚工艺研究[J].黑龙江科学,2024,15(08):6-9+13.
