摘  要:目的：基于网络药理学方法探究罗布麻治疗非酒精性脂肪肝的作用机制。方法：检索中药系统药理学数据库及文献获取罗布麻活性成分及靶点，通过GeneCards、OMIM、TTD等数据库获取非酒精性脂肪肝病相关靶点。借用String数据库对罗布麻与疾病的共同靶点构建PPI网络；利用Cytoscape软件对共同靶点进行分析以得到罗布麻治疗非酒精性脂肪肝核心作用靶点，再利用DAVID数据库对共同靶点进行富集分析。结果：筛选得到罗布麻治疗非酒精性脂肪肝核心成分20个，核心靶点包括TP53、SRC、HSP90AA1等45个，涉及癌症、脂质和动脉粥样硬化、前列腺癌、乙型肝炎、AGE-RAGE等信号通路。结论：揭示了罗布麻治疗非酒精性脂肪肝的多成分、多靶点、多通路作用特点，为深入研究罗布麻缓解非酒精性脂

关键词:罗布麻；网络药理学；非酒精性脂肪肝；靶点；作用机制

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是因饮食习惯、肥胖等因素导致人体肝细胞内脂肪过多积聚而引起的一种代谢综合征^[1]。在我国，其发病率逐年上升，总体患病率为29.8%^[2]。近年来研究发现，多种药食同源植物具有保肝护肝作用，比如罗布麻(Apocynum venetum L.)，其叶可做保健食品用外，同时被《中国药典》2020年版收录，具有平肝安神、清热利水的功效。现代药理学实验表明，罗布麻提取物具有降血脂、降肝脂、抗氧化应激和改善代谢综合征大鼠脂肪性肝病的作用，此外还可显著缓解对乙酰氨基酚(APAP)、四氯化碳、d-半乳糖胺/脂多糖诱导的小鼠肝损伤^[3-7]。但至今未发现罗布麻抗非酒精性脂肪肝作用机制方面的文献报道。基于此，本文以罗布麻抗非酒精性脂肪肝药效成分为研究对象，应用网络药理学方法探讨其治疗非酒精性脂肪肝疾病多成分、多靶点、多路径的作用机制，为开发绿色健康的特医食品和功能食品奠定理论基础。

1 资料与方法

1.1 罗布麻化学成分及作用靶点收集

通过中药系统药理数据库与分析平台(TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)及文献调研等收集罗布麻所含化学成分。借用Swiss Drug Design(http://swisstargetprediction.ch/)、SuperPred webserver、Targnet、STITCH等数据库获取罗布麻所含化学成分的作用靶点，并通过UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)对靶点进行规范化处理以获得标准基因名。

1.2 非酒精性脂肪肝疾病靶点收集

以“Nonalcoholic fatty liver disease”、“Non-alcoholic fatty liver disease”、“Non alcoholic fatty liver disease”、“NAFLD”为关键词在GeneCards数据库(https://www.genecards.org)、OMIM数据库(http://www.omim.org)、TTD数据库(http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd)、DisGeNET(https://www.disgenet.org/search)数据库中检索，经合并去重后得到非酒精性脂肪肝病关联靶点。

1.3 获取罗布麻与非酒精性脂肪肝病共同靶点

使用Venny 2.1.0在线平台(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)对罗布麻作用靶点与非酒精性脂肪肝疾病靶点取交集，得到罗布麻与非酒精性脂肪肝病的共同靶点。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用网络构建与分析

利用STRING数据库构建蛋白质—蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络图，将1.3中的共同靶点导入STRING数据库，物种选择“Homosapiens”，最低相互作用评分设置为0.700，相关游离节点隐藏，其余设置不变，得到PPI网络及相关数据，再将相关数据导入Cytoscape3.9.0软件绘制PPI网络图。PPI网络图可为提取罗布麻治疗非酒精性脂肪肝病核心靶点提供依据，另以核心靶点Degree值为标准，确定罗布麻抗非酒精性脂肪肝病的关键化学成分。

1.5 GO 功能富集和 KEGG 通路富集分析

将1.3中的共同靶点输入DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)数据库，分别进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析；其中GO又分为生物过程(BP)、分子功能(MF)和细胞组成(CC)三类，且以P＜0.01为筛选条件，分别选取前10个生物学条目绘制条形图。KEGG富集分析同样以P＜0.01为显著富集筛选条件，选取前15条信号通路绘制气泡图进行可视化分析。

2 结果

2.1 罗布麻活性成分的收集及靶点预测

经TCMSP、国家科技图书文献中心、Swiss Drug Design、SuperPred webserver、Targnet、STITCH等数据库，共获得罗布麻活性成分124种^[8-14]，涉及929个靶点。

2.2 非酒精性脂肪肝病靶点筛选

借助GeneCards、OMIM、TTD、DisGeNET数据库，经整合处理后共得到非酒精性脂肪肝病作用靶点6720个。利用Venny平台，得到罗布麻与非酒精性脂肪肝疾病的共同靶点678个，绘制韦恩图，见图1。

2.3 PPI 蛋白网络图及数据分析

在STRING数据库中导入2.2中的共同靶点，并借助Cytoscape 3.9.0软件，可得到拥有643个节点，11418条边的PPI网络图(见图2)，筛选度值Degree前45的靶点为核心靶点(见表1)。将核心靶点归入到罗布麻各化学成分中，计算出各个化合物所对应的核心靶点Degree值之和，以得到罗布麻治疗非酒精性脂肪肝病的关键化学成分，见表2。

2.4 GO功能富集分析和 KEGG 通路分析

利用DAVID数据库对678个共同靶点分别进行GO和KEGG分析。其中GO功能富集分析包括生物过程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)、细胞组成(cellular component，CC)三部分，并将各自前10条目绘制条形图，横坐标代表GO的各个条目，纵坐标代表富集到与该条目的靶点数目，见图3。BP主要涉及蛋白磷酸化、肽基丝氨酸磷酸化、肽基络氨酸磷酸化、炎症反应、凋亡过程的负调控、对脂多糖的反应、细胞增殖的正调控等生物过程；MF主要包括蛋白激酶活性、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、ATP结合、RNA聚合酶II转录因子活性、配体激活的序列特异性DNA结合等功能；CC主要包含质膜、胞液、受体复合物、神经元细胞体、细胞表面等组成。将KEGG通路富集分析的前15条通路绘制气泡图进行可视化分析，主要涉及癌症通路、脂质和动脉粥样硬化、前列腺癌、乙型肝炎、AGE-RAGE等信号通路，如图4所示。

3 结论

罗布麻(Apocynum venetum L.)为夹竹桃科罗布麻属植物，直立半灌木，又称茶叶花、野麻、野务其干(新疆维语)等。国内主要分布于新疆、青海、甘肃及内蒙古等省区，广泛野生在盐碱荒地、沙漠边缘、戈壁荒滩及河流两岸等地。该植物具有保肝护肝、抗氧化、抗癌抑菌、调节脂质代谢平衡等多种生物活性[15-17]，本研究通过网络药理学进一步研究罗布麻保肝的作用机制，为其应用开发奠定基础。

网络药理学分析结果显示，罗布麻作用于非酒精性脂肪肝的关键化学成分为奎宁酸、四甲基吡嗪、槲皮素、东莨菪内酯等。其中奎宁酸具有较强的抗氧化性、DNA修复和免疫调节功能^[18]。四甲基吡嗪通过抑制炎症因子和p-NF-B/ROS信号通路，对非酒精性脂肪肝小鼠具有显著的肝保护作用^[19]。槲皮素具有抗氧化性、降血压、降血脂等作用，并有实验证明槲皮素可减轻模型鼠炎症、氧化应激和脂质代谢以治疗NAFLD^[20]。东莨菪内酯通过减轻内质网应激和氧化应激，进而保护肝细胞^[21]，此外还可促进胰岛素分泌^[22]，调节脂质代谢和炎症基因来改善非酒精性脂肪肝病^[23]。

本研究表明罗布麻治疗非酒精性脂肪肝病的核心靶点为TP53、SRC、HSP90AA1、MAPK3、AKT1、MAPK1等。TP53是目前常见的抑癌基因，在非酒精性脂肪肝患者的肝组织中表达显著^[24]，实验发现若抑制TP53表达可减缓肝细胞衰老或凋亡以及脂质的过度积累和氧化应激^[25]，进而缓解非酒精性脂肪肝病的发展。SRC激酶是治疗乳腺癌等多种肿瘤发生、发展、迁移、侵袭的一个抗肿瘤药物靶点，大量实验证明，抑制SRC的磷酸化可缓解非酒精性脂肪肝炎^[26]、阻止肝癌细胞侵袭和迁移，减缓肝癌进展^[27-28]。

KEGG富集分析显示，罗布麻治疗非酒精性脂肪肝病主要涉及癌症、脂质和动脉粥样硬化、前列腺癌、乙型肝炎、AGE-RAGE等信号通路。最近研究表明，非酒精性脂肪肝病患者在氧化应激、炎症反应、免疫反应、肝细胞功能改变、胰岛素抵抗及脂肪源性激素等因素作用下，可促使动脉粥样硬化发生^[29]。武钰林等^[30]研究发现乙肝病毒X蛋白通过增强肝脏脂肪酸结合蛋白表达以促进胰岛素抵抗，进而增加患NAFLD的概率。此外，研究发现^[31]AGE-RAGE信号通路不仅可激活NF-κB、TGFβ、VEGF，还可增强炎性因子释放，以促进非酒精性脂肪肝病发展。推测罗布麻可能通过干预癌症、脂质和动脉粥样硬化、前列腺癌、乙型肝炎、AGE-RAGE等信号通路以缓解非酒精性脂肪肝病的发生发展。

综上所述，罗布麻可能通过奎宁酸、四甲基吡嗪、槲皮素、东莨菪内酯等活性成分作用于TP53、SRC、HSP90AA1等靶点，调节NAFLD相关通路，以治疗非酒精性脂肪性肝病。本研究结果证实了罗布麻抗非酒精性肝病多成分、多靶点、多通路干预的作用特点，为进一步研究罗布麻缓解NAFLD提供了理论依据。但网络药理学分析方法具有一定的局限性，后续将进一步开展体内外验证实验，以明确罗布麻抗NAFLD的主要调控靶点。

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