摘 要：目的：优化罗布麻冲剂的水提工艺并确定其参数。方法：以金丝桃苷转移率、总黄酮含量以及出膏率为评价指标，采用高效液相色谱法和紫外分光光度计法测定指标含量，AHP－CRITIC混合加权法确定各指标权重系数，设计L9(34)正交试验筛选罗布麻叶冲剂的水提工艺中提取次数、提取时间和加水倍量，并进行验证试验。结果：AHP－CRITIC混合加权法确定金丝桃苷转移率、总黄酮的含量以及出膏率的权重分别为0.4768，0.4346和0.0886，筛选的提取工艺为罗布麻叶加10倍量水、加热回流3次，每次0.5h。3次验证试验结果显示，金丝桃苷的提取率为90.29%，总黄酮的含量为105.84mg/g，出膏率为29.87%，综合评分为98.44(RSD=1.86%，n=3)。结论：优选的罗布麻冲剂水提工艺重复性好、稳定可行，可为罗布麻冲剂的工业化生产提供参考。
关键词：罗布麻冲剂；提取工艺；正交试验；AHP-CRITIC1
罗布麻叶系夹竹桃科植物罗布麻Apocynum venetum L.的干燥叶，具有平肝安神、清热利水之功效，用于肝阳眩晕、心悸、失眠等［1］，是单方制剂罗布麻冲剂的处方药材。罗布麻叶临床上常用治疗高血压，其特点是降血压平稳和不良反应小。现代研究［2－3］发现，罗布麻叶中主要含黄酮类、有机酸类、鞣质、糖类、氨基酸类和矿物质元素等化学成分，其中黄酮类单体化合物金丝桃苷是《中国药典》2020年版一部中罗布麻叶的含量测定指标；罗布麻叶提取物具有降血压、降血脂、增加冠状动脉流量等药理作用；罗布麻叶中的总黄酮类成分，如槲皮素、异槲皮苷等，可以通过调节脂质代谢抑制CRP和TGF-β1因子的表达发挥抗血压作用，也能减轻高血脂导致的血管内皮损伤和改善体内氧化应激水平实现对血脂代谢的调节。查阅文献，尚未发现采用层次分析法(analytic hierarchy process，AHP)、指标重复性相关法(criteria importance through inter-criteria correlation，CRITIC)及 AHP-CRITIC混合加权法结合正交试验优选罗布麻冲剂的水提工艺的研究。故本研究以金丝桃苷转移率、总黄酮的含量与出膏率作为评价指标，采用多指标权重分析法对实验结果进行综合评定，SPSS20.0软件对综合评分进行方差分析筛选科学合理的权重系数；结合正交试验法对罗布麻叶的提取工艺进行优化，确定罗布麻冲剂的最佳水提取工艺参数，旨在为罗布麻叶冲剂新药的质量标准和稳定、可行的生产工艺提供实验依据。
1 仪器与材料
1.1 仪器
Agilent-1260高效液相色谱仪(四元泵、DAD检测器、OpenLAB色谱工作站、美国安捷伦)；UV-765紫外可见分光光度计(上海精科)；BP211D型十万分之一(梅特勒-托利多)，BS110S型万分之一电子天平(北京赛多利斯)；Water Purifier超纯水机(四川沃特尔)。
1.2 材料
罗布麻药材由广西南药药业有限公司提供，经新疆药物研究所何江研究员鉴定，符合2020年版《中国药典》相关项下要求。金丝桃苷对照品(批号：111521-201507)，芦丁对照品(批号：100080-200707)，均购自中国食品药品检定研究院；色谱甲醇、色谱乙腈(美国Fisher)，其余试剂均为国产分析纯。
2方法与结果
2.1 实验方法
称取药材10g，按照正交试验表所设计的条件，加水回流提取并过滤，合并滤液，放置至室温，加水定容至1000mL，备用。
2.2 金丝桃苷含量测定方法
2.2.1 金丝桃苷对照品溶液的制备
取金丝桃苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含467.86μg的溶液，即得储备液。再精密量取储备液1mL，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，再精密量取5mL，置10mL量瓶中，制成每1mL含23.3929μg的溶液，即得。
2.2.2 供试品溶液的制备
精密称取罗布麻叶药材10g，加10倍量水回流提取3次，每次30min；合并滤液，放置室温，定容至1000mL，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.2.3 色谱条件的确定
本实验的色谱条件参照《中国药典》2020年版一部罗布麻叶药材中的含量测定方法。用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(AgilentExtend-C18250mm×4.6mm，5μm)；以乙腈-0.2%磷酸溶液(15∶85)为流动相；检测波长为256nm。柱温为30℃，流速为1.0mL/min，理论板数应不低于6000。HPLC图谱如图1所示。
图1 金丝桃苷供试品和对照品溶液的HPLC图
2.2.4 金丝桃苷线性关系考察
分别精密吸取“2.2.1”项下的对照品储备液溶液0.1mL、0.25mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL，加甲醇分别稀释至10mL，分别精密吸取稀释液10μL，按“2.2.3”项下色谱条件下进样，以对照品质量浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程：金丝桃苷Y=28.522X-16.46(R=0.9997)。结果表明，金丝桃苷在4.68～93.57μg/mL浓度范围内线性关系良好。
2.2.5 精密度实验
精密吸取同一浓度的金丝桃苷对照品溶液连续进样6次，每次10μL，记录峰面积，计算RSD值。结果金丝桃苷峰面积RSD为0.89%。表明精密度良好。
2.6 确定权重系数
2.2.6重复性实验按“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液6份，每次进样10μL，测定金丝桃苷的峰面积，计算金丝桃苷的含量，RSD值为1.35%，表明该方法重复性良好。
2.2.7 稳定性实验
精密吸取同一供试品溶液，室温下分别于0h、2h、4h、8h、12h、24h进样，每次10μL，记录峰面积，计算金丝桃苷含量，结果金丝桃苷RSD为1.75%。
2.2.8 加样回收率
精密称取已知含量的罗布麻叶样品6份，每份5g。精密加入与罗布麻药材中近似等量的金丝桃苷对照品溶液。按“2.2.2”项下的方法处理样品，按含量测定方法测定含量。计算出金丝桃苷回收率为98.94%，RSD为2.88%(n=6)。
2.3 总黄酮含量测定方法［4］
2.3.1 芦丁对照品溶液的制备
取芦丁对照品20mg，精密称定，置10mL量瓶中，加甲醇适量，置水浴上微热使溶解，放冷，加甲醇至刻度，摇匀。精密量取5mL置50mL量瓶中，加甲醇置刻度，摇匀，即得(每1mL含200μg的溶液)。
2.3.2 标准曲线的建立
分别精密吸取芦丁对照品溶液1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL与8mL，分别置25mL量瓶，各加水至6mL，加5%亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，放置6min，加10%硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置6min，加氢氧化钠试液10mL，再加水至刻度，摇匀，放置15min，以相应的试剂为空白，照紫外分光光度法(通则0401)，在503nm处测定吸光度(A)。以芦丁浓度(mg/mL)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标进行线性回归分析，得到线性回归方程A=13.134C+0.0364(r=0.9995)，表明芦丁浓度在6.5～51.9μg/mL与吸光度的线性关系良好。
2.3.3 精密度实验
精密吸取同一浓度的芦丁对照品溶液，按标准曲线的建立项下操作，加入显色剂显色后，测定吸光度；连续6次，计算RSD值为0.31%。表明精密度良好。
2.3.4 重复性实验
按“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液6份，加入显色剂显色后，测定吸光度，计算总黄酮含量的RSD值为1.44%，表明该方法重复性良好。
2.3.5 稳定性实验
精密吸取同一供试品溶液，按标准曲线的建立项下操作，显色后，分别在0min、5min、10min、20min、30min、40min、50min、60min、80min测定其吸光度。计算总黄酮含量的RSD值3.81%。表明供试品溶液在80min内稳定良好。
2.3.6 加样回收率
精密称取已知含量的罗布麻叶样品6份，每份5g。精密加入与罗布麻药材中近似等量的芦丁对照品溶液。按“2.2.2”项下的方法处理样品，按标准曲线的建立项下操作，加入显色剂显色后，测定吸光度。计算出芦丁回收率为96.74%，RSD为2.86%(n=6)。
2.3.7 样品测定
精密吸取“2.1”项下药液5mL置10mL量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，得供试品溶液，分别吸取各供试品溶液1mL于25mL量瓶中，加5%亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，放置6min，加10%硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置6min，加氢氧化钠试液10mL，再加水至刻度，摇匀，放置15min，以相应的试剂为空白，照紫外分光光度法(通则0401)，在503nm处测定吸光度(A)。计算样品中总黄酮含量。
2.4 出膏率测定
精密吸取“2.1”项下静置过夜后的供试品溶液25.0mL，置于已恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，于105℃干燥5h，取出，置干燥器中冷却0.5h，精密称定重量，根据公式：出膏率=干膏质量×40/药材质量×100%，计算出膏率。
2.5 正交试验优化提取工艺
单因素实验确定了各因素各水平的用量范围，在此基础上，以提取次数、提取时间和加水倍量为因素分配各水平。因素水平安排见表1，结果见表2。
表1因素水平表
表2 L9(34)正交试验表及结果
2.6 确定权重系数
2.6.1 AHP法［5］确定权重系数
根据中药中有效成分含量的高低和药理作用的强弱，本研究将金丝桃苷转移率、总黄酮含量和出膏率3个指标给予主观量化，并确定各个指标的优先顺序为金丝桃苷=总黄酮＞出膏率。根据此顺序，采用SPSS20.0软件构建各指标成对比较的判断优先矩阵，给予各项指标的相对评分(表3)，并对矩阵进行归一化处理，计算出权重系数分别为0.4286、0.4286、0.1429，最大特征根为3.000，一致性指标(CI)为0.000；由矩阵阶数为3得到随机一致性指标(RI)为0.520，一致性比率(CR)为0.000(＜0.1)，即指标优化比较矩阵通过一致性检验，表明各评价指标权重系数合理有效。
表3 指标成对比较的判断优先矩阵表
2.6.2 CRITIC法［6］确定权重系数
CRITIC方法是一种客观的权重赋值方法，以评价指标间的对比强度及冲突性作为基础，通过计算标准差将对比强度及冲突性体现出来的计算方法，可客观反映各评价指标的权重值。标准差来表示对比强度，其值越小，权重越小；相关系数表示冲突性，相关系数越大，权重越大。中药化学成分种类繁多，各成分对总体药效的贡献大小不同。故本研究通过CRITIC法确定罗布麻冲剂中金丝桃苷转移率、总黄酮的含量和出膏率的权重。对表2中正交实验结果数据通过公式，即［指标成分值=(实测值-最小值)/(最大值-最小值)×100］，进行标准化处理以消除单位量纲。SPSS20.0软件得到各评价指标的相关系数矩阵A，由矩阵计算对比强度即指标内数值标准差(σj)、冲突性(Rj)、综合权重(Cj)与权重(Wj)，计算结果见表4。表4表明，CRITIC法计算得到的金丝桃苷转移率、总黄酮含量和出膏率的权重系数分别为0.4050，0.3692和0.2258。
A=10.9720.9850.97210.9900.9860.9901
表4 相关计算数据表
2.6.3 AHP-CRITIC混合加权法确定权重系数
AHP方法将评价指标依据主观判断进行两两比较的优先信息给予量化，得到主观权重系数；体现了中药中指标成分在药效方面的差异。CRITIC法考虑到了指标内的变化程度和两个指标间的一致性对赋权结果的影响，使评价结果更加科学合理。综合二者的优点，根据公式ω综合ij=ωAHPijωCRITICij/∑ωAHPijωCRITICij(式中，ωAHPij表示AHP法计算的权重系数，ωCRITICij表示CRITIC法计算的权重系数，i表示第i个因素，j表示第j个样本)计算综合权重，得到金丝桃苷转移率、总黄酮含量和出膏率3项指标权重系数分别为0.4768，0.4346和0.0886。
2.7 综合评价结果比较
分别用AHP法、CRITIC法及AHP-CRITIC混合加权法得到的权重对试验结果进行综合评分，结果见表5，采用SPSS20.0软件对3种权重法得到的结果进行相关性分析。结果发现两两之间差异不明显，相关系数均在0.999以上，三者相关性显著(P＜0.01)，即3种赋权法得到的综合评分结果具有一致性。但采用spss20.0软件对权重系数分析，AHP法与CRITIC法的相关系数为0.982，两者相关性不显著(P=0.121＞0.05)，即二者相关性没有统计学意义，说明这两种方法所反映的信息不具有叠加性。对比而言，AHP-CRITIC混合加权方法兼顾主客观两方面，反映的信息比单一方法更全面、更科学、更合理、更符合实际。
表5 3种赋权法综合评分结果
2.8 正交试验结果分析
采用AHP-CRITIC混合加权法确定的各指标权重对正交试验实验结果进行综合评分，优选最佳水提取工艺。
采用SPSS20.0数据统计软件对正交试验结果进行分析，表6直观分析数据表明，各因素对金丝桃苷转移率、总黄酮含量和出膏率的综合评分的影响为A＞B＞C，表7方差分析结果显示，因素A提取次数对实验结果具有显著性影响(P＜0.05)，因素B提取时间和因素C加水倍量无显著性影响(P＞0.05)，结合大工业生产成本，得最佳工艺参数为A3B1C1，即10倍量水，加热回流3次，每次0.5h。
表6 直观分析表
表7 方差分析表
2.9 工艺验证
称取3份药材，按照之前筛选出的最佳提取工艺分别进行回流提取，检测回流提取液中金丝桃苷转移率和总黄酮含量以及出膏率。结果见表8。
表8 水提取验证实验结果统计表(n=3)
由表8可知，3个指标的综合评分RSD值小于2.0%，表明所优选工艺稳定、可行，可用于罗布麻冲剂的水提工艺研究。
3 讨论
现代药理学研究［2］表明，罗布麻叶对预防和治疗高血压和高血脂有较好疗效，而黄酮类成分是其发挥此类作用的主要成分，黄酮类化合物金丝桃苷是罗布麻叶的质量控制指标。本研究发现，采用《中国药典》收载的罗布麻叶中金丝桃苷含量测定的方法，金丝桃苷主峰与其后一个较大的杂质峰不易分开，根据文献得知该杂质峰为与金丝桃苷的结构相似的黄酮类化合物——异槲皮苷［7］，故我们在后期的研究中优化了流动相的比例，使之达到较好的分离。
本研究测定了罗布麻水提溶液中总黄酮的含量，比色法检测总黄酮含量的方法有亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠络合比色法、AlCl3比色法等［8］；首先采用AlCl3比色法在415nm处测定，发现罗布麻水提溶液用AlCl3-CH3COOK处理后在415nm处没有吸收峰。采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠络合比色法时，芦丁(对照品)和样品溶液在503nm处均有吸收峰，且有文献研究证实［9-10］。故本研究中罗布麻叶总黄酮的含量测定采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠络合比色法。
目前中药提取工艺常用多指标权重综合评分法，权重系数的建立是多指标评价中主要考虑的问题。权重的确定方法有为主观赋权方法和客观赋权方法两种；主观赋权方法主观性较强，对实验的影响因素不能更全面、更客观的评价；例如专家打分法和AHP法。客观权重系数是指经过对实际发生的资料进行整理、计算和分析而得出的权重系数，例如主成分分析法、CRITIC法等［11-12］。本实验采用主观权重系数确定方法——层次分析法得到的权重为0.4286、0.4286、0.1429，客观赋权方法(CRITIC法)确定的权重为0.4050、0.3692、0.2258，AHP-CRITIC混合加权法得到的权重为0.4768，0.4346和0.0886。利用SPSS20.0软件对三种权重系数和各权重确定的综合评分分别进行相关性分析，发现单一的AHP或CRITIC赋权方法得到的权重系数过于片面。故本实验综合两种赋权方法的优点，采用AHP-CRITIC混合加权法；不仅体现了经验主观信息，也显现出客观数据信息，相比于单一的赋权法更能全面科学的体现稳定可靠的数据信息。
通过正交实验优化罗布麻冲剂的水提工艺参数，采用SPSS20.0软件对正交试验综合评分的结果进行直观和方差分析，得到最佳工艺为：10倍量水、加热回流3次、每次0.5h。验证实验结果说明优化工艺合理、稳定可行、重复性良好。为罗布麻冲剂的成型工艺和工业化大生产提供了数据支持，实际应用价值较大。
致谢：感谢新疆维吾尔自治区药物研究所科教科何承辉老师为本实验提供指导。
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