摘 要：本发明公开了一种红麻干旱响应基因EST SSR引物及试剂盒。所述引物共有11对，其中的一对或者多对作为EST SSR多态性标记用于鉴定红麻亲缘关系、遗传多样性或者抗旱相关基因特定外显子区简单重复序列多态性差异。本发明为红麻分子标记辅助育种提供良好的标记储备，也为在红麻自然变异中筛选关键基因的功能等位变异提供一种检测的候选分子标记。
权力要求书
1.一种红麻干旱响应基因EST-SSR引物组，其特征在于，所述引物组由11对引物组成，具体如下：
第1对引物，其序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；
第2对引物，其序列如 SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：2所示；
第3对引物，其序列如 SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示；
第4对引物，其序列如 SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示；
第5对引物，其序列如 SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示；
第6对引物，其序列如 SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示；
第7对引物，其序列如 SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示；
第8对引物，其序列如 SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15所示；
第9对引物，其序列如 SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17所示；
第10对引物，其序列如 SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO：19所示；
第11对引物，其序列如 SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21所示。
2.一种鉴定红麻亲缘关系、遗传多样性或者抗旱相关基因特定外显子区简单重复序列多态性差异的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1中所述的引物组。
技术领域
本发明涉及EST-SSR标记，具体而言，是红麻干旱响应基因EST-SSR引物及试剂盒，属于生物技术领域。
背景技术
红麻（Hibiscus cannabinus L.）是锦葵科木槿属的一年生重要的韧皮纤维作物,主要用于纺织，也用于制作纸浆、生物质能源、建材等方面。因此，大力发展麻类作物尤其是红麻是满足人们对天然纤维不断增加的需求量的重要途径之一。红麻生长适应性强，尤其是抗旱能力强，能在山坡丘陵地区种植，不与粮食争地。随着全球气候恶性变化和水资源日益短缺，选育抗旱性较强的红麻品种也显得越来越重要。
EST-SSR标记是对表达序列标签(expressed sequence tag , EST)中的简单重复序列(simple sequence repeat , SSR)进行开发的一种新型分子标记，与其他的分子标记相比，EST-SSR标记具有高效、成本低等优点，可用于种质资源遗传多样性分析、亲缘关系鉴定以及分子辅助育种工作中。此外，有目的性地针对某一类基因开发EST-SSR标记，可以对种质资源特定性状相关的基因外显子区功能性变异的多态性差异进行分析，反映种质资源在这些基因特定区段的差异，可更方便快捷地定位和克隆相关性状功能基因。
目前，已相继在黄瓜、小麦、水稻、花生、棉花等物种中开展了EST-SSR标记研究。与这些物种相比，红麻EST-SSR标记开发滞后，NCBI数据库中注册的红麻核苷酸序列仅423条（截至2018年1月3日）。红麻的分子标记目前主要为随机标记，如RAPD、ISSR和SRAP等，有针对性的分子标记开发较少，相对信息量较少且缺乏可以参考的基因组图谱信息，严重限制了红麻的遗传改良。例如，郑海燕等以来源于不同国家和地区的51份红麻野生种、近缘种和栽培种为材料,利用ISSR和RAPD标记构建红麻种质资源分子身份证；刘倩等以来源于不同国家和地区的127份红麻栽培种、野生种和近缘种为材料，利用SRAP标记构建红麻种质资源分子身份证；徐伟等利用RAPD分子标记对红麻12个野生种、7个常规栽培种和5个近缘种进行了亲缘关系研究；万雪贝等开发的85个转录因子EST-SSR标记在至少2个红麻材料之间存在多态性。而分子标记的数量和质量影响着种质源遗传多样性分析的准确性，现有的红麻SSR分子标记远不能满足需求。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种红麻干旱响应基因EST-SSR引物及试剂盒。
一种红麻干旱响应基因EST-SSR引物，所述引物共有11对，其中的一对或者多对作为EST-SSR多态性标记用于鉴定红麻亲缘关系、遗传多样性或者抗旱相关基因特定外显子区简单重复序列多态性差异；所述引物，分别为 ：
第1对引物，其序列如 SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；
第2对引物，其序列如 SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：2所示；
第3对引物，其序列如 SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示；
第4对引物，其序列如 SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示；
第5对引物，其序列如 SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示；
第6对引物，其序列如 SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示；
第7对引物，其序列如 SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示；
第8对引物，其序列如 SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15所示；
第9对引物，其序列如 SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17所示；
第10对引物，其序列如 SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO：19所示；
第11对引物，其序列如 SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21所示。
一种鉴定红麻亲缘关系、遗传多样性或者抗旱相关基因特定外显子区简单重复序列多态性差异的试剂盒，所述的引物中的一对或者多对。列多态性差异的试剂盒，所述的引物中的一对或者多对。
本发明的有益效果是：
本发明的11个EST-SSR标记是标记了红麻响应干旱胁迫的关键基因外显子区的简单重复序列多态性，并且在遗传变异来源广泛的红麻品种中具有多态性，可以区分44个红麻品种。通过5个品种的初步筛选和44个品种的验证，这11个多态性标记可稳定检测，可以直接将本发明所开发的标记应用于更多红麻品种的检测，进行种质资源分子遗传多样性评价、亲缘关系鉴定和关键抗旱基因的特定外显子区简单重复序列多态性分析，为红麻分子标记辅助育种提供良好的标记储备，也为在红麻自然变异中筛选关键基因的功能等位变异提供一种检测的候选分子标记。
附图说明
图1是红麻响应干旱胁迫代谢途径关键基因EST-SSR标记开发流程图；
图2是本发明的部分红麻EST-SSR标记扩增44个红麻品种的扩增效果图；
图3是基于11个标记基因型的44个红麻品种非加权类平均(UPGMA)聚类分析图。
具体实施方式
红麻响应干旱胁迫代谢途径关键基因的EST-SSR标记，是对红麻干旱胁迫转录组测序、响应干旱胁迫代谢途径富集分析、EST-SSR标记开发、DNA提取、SSR引物筛选及品种鉴定等过程得到的（图1）。
本发明中，用红麻转录组测序数据得到干旱胁迫关键基因开发红麻EST-SSR引物的具体做法是：
一、红麻干旱胁迫转录组测序
利用RNAprep Pure Plant Kit (Tiangen生物技术，中国)从对照组(正常浇水6天)、干旱处理组(抑制浇水6天)、复水处理组（抑制浇水5天后复水1天）的红麻叶片中提取总RNA，3次重复。然后通过凝胶电泳和NanoDrop 2000 分光光度计（Thermo，美国）来检验RNA的质量、浓度和完整性。从六个样本中分别提取20 ug RNA做cDNA文库构建。六个样品的RNA完整度分别是为6.7、7.5、6.5、7.4、6.9和7.5。在Illumina HiSeq4000基因组分析仪中进行测序。
二、SSR标记开发
通过红麻转录组测序得到差异表达基因的KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因和基因组百科全书)通路显著性富集分析，确定差异表达基因，及其参与的最主要生化代谢途径和信号转导途径。干旱处理组与对照组比较，富集显著的通路是光合通路（Photosynthesis）（表1）；复水处理组与对照组比较，富集显著的通路是淀粉和蔗糖代谢通路（Starch and sucrose metabolism）（表1）；复水处理组与干旱处理组比较，富集显著的通路是植物激素信号转导通路（Plant hormone signal transduction）（表1）。很显然，这一结果表明：对干旱胁迫信号响应最灵敏的是光合通路，受到干旱胁迫之后，最难恢复正常水平的是淀粉和蔗糖代谢通路，而明显受到干旱胁迫诱导表达的是植物激素信号转导通路。这三个通路中的差异表达基因中，干旱处理组与对照组比较表达上调的unigene（Unique Gene，拼接基因）（表1）、复水处理组与干旱处理组比较表达下调的unigene（表1）、复水处理组与对照组比较表达上调的unigene（表1），利用MISA(1.0版)含有SSR的重复基元，选择SSR位点的重复基元为以单核苷酸为重复单位时，其重复次数≥10，二核苷酸重复次数≥6次，三、四、五、六核苷酸重复次数≥5次进行SSR检测。SSR序列用软件Primer3.0（2.3.5版）进行SSR引物设计。
三、品种DNA提取
利用改良CTAB方法提取44个红麻品种（表2）基因组DNA，具体步骤如下：
(1)配置DNA提取缓冲液：4% CTAB , 100 mmol/L Tris-HCl （pH8.0）,20mmol/L EDTA, 1.4mol/L NaCl、2% β-巯基乙醇和10 mg/ml的RNAase酶。
(2)对上述红麻品种进行如下处理：
A、称取红麻叶片约0.5g，在液氮中迅速冷却后，将其研磨至粉末，随后将粉末样品转入2ml干燥无菌离心管中，加入850ul 65℃预热的CTAB提取液后，轻柔缓慢颠倒混匀约2min，放入65℃水浴锅中裂解30-45min，期间每隔5min左右轻轻颠倒混匀；加入等体积850ml氯仿：异戊醇（24:1）颠倒混匀3min，4℃10000rpm条件下离心10min，取上清液转入新的无菌离心管中，加入850ml等体积的氯仿：异戊醇（24:1）颠倒混匀约3min，4℃10000rpm条件下离心10min。
B、吸取上述步骤A所得的上清液转入2ml新的无菌离心管中，分别加入1/3体系的2.5mol/L的NaAc及等体积的-20℃预冷的异丙醇，轻柔颠倒混匀至DNA絮状沉淀出现，然后冰上静置30min；16℃ 2000rpm条件下离心10min，弃上清液。
C、将上述步骤B所得DNA沉淀转入1.5ml新的无菌离心管中，用1ml的75%无水乙醇漂洗2min，室温条件下10000rpm离心2min，弃上清液，重复洗一次。
D、将上述步骤C洗涤后的DNA室温下风干4小时，加入37℃条件下预热的100ulTE溶解风干后的DNA，加入1ul的RNAase（10mg/ml），37℃水浴1小时。
E、然后通过0.8%琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000 分光光度计（Thermo，美国）来检验DNA的质量、完整性和浓度。
四、EST-SSR标记引物筛选
以步骤三提取的待测样品中，选择来源广泛、表型差异大的5个红麻品种（来源于危地马拉的HC8、来源于日本的HC19、来源于美国的HC20、来源于泰国的HC36和来源于中国长沙的HC62）(表2)基因组DNA为模板进行步骤二所得的64对EST-SSR标记引物的筛选。PCR 体系采用20μl反应体系：10×含rTaq的Mix 10μl，Sense Primer 1μl，Anti-sense Primer 1μl，基因组DNA 1μl，ddH2O 7μl。在PCR仪上进行扩增，扩增程序为94℃预变性3分钟，94℃ 30秒，56℃ 15秒，72℃ 30秒，返回第二步，重复35个循环，72℃ 5分钟，然后4℃保存。PCR产物在6%的PAGE胶上进行电泳，电泳完成后经过漂洗，染色和显色，在背光灯下进行读带记录和拍照。64个EST-SSR标记在5个品种中有12个标记可以扩增得到多态性片段（部分引物对扩增结果如图2所示）。
五、遗传多样性分析
根据步骤四分析结果，得到了12对多态性标记引物，然后将这12个标记在44个红麻品种(表2)中进行上述步骤四中相同条件的PCR扩增，扩增产物以步骤四相同方法电泳，统计扩增得到的条带。出乎我们的预料，结果发现12对多态性标记引物只有11个标记稳定地重复出了多态性扩增片段（部分引物对扩增结果如图2所示）。对这11个得到验证的EST- SSR标记进行遗传多样性分析发现，11个EST-SSR标记，总计得到了19个等位基因。平均每个标记位点主要等位基因频率（MAF）平均为0.747，分布在0.5208-0.9792之间；每位点基因型数目平均为2.7273，分布在2-5之间；每位点等位基因数目平均为2.3636，分布在2-4之间；基因多样性平均为0.3388，分布在0.0408-0.5182之间；多态性信息含量（PIC）平均为0.2767，分布在0.0400-0.4038之间。
六、品种鉴定
根据群体验证的11个多态性标记的基因型计算44个品种(表2)两两间的遗传相似系数，两两间遗传相似系数平均为0.5650，HC16与HC19遗传相似系数最小，为0.1765；HC31与HC32、HC47与HC62遗传相似系数最大，为0.9167。显然，这一结果表明：这11个标记可以较好的区分开这44个品种，可以将除HC16和HC19之外的其他42个品种聚类为明显的两大类（图3）。这说明，这11个标记在对品种鉴定区分上也有非常高的应用价值。
本发明提供11个红麻EST-SSR标记，11个EST-SSR标记的特征如表3所示：
最后，还需要注意的是，以上所述仅是本发明的若干个具体实施例而已，本发明不限于以上实施例，还可以有各种改动和变形。
摘自国家发明专利，发明人：安霞，金关荣，王斌，吴文嫱，骆霞虹，陈常理，李文略，李苹芳，朱关林，申请号：201810056728.4，申请日：2018.01.21
