摘 要：为了深入了解亚麻种质产量相关性状的遗传变异，以229份亚麻种质为材料，利用广义线性模型(GLM)和混合线性模型(MLM)的关联分析，以挖掘亚麻产量相关性状显著关联的SSR标记?结果表明，呼和浩特地区种植亚麻种质株高((58.40±5.67)cm)?单株果数((17.50±3.50)个)和单株粒质量((0.55±0.15)g)的平均值最大；在集宁地区分枝数((5.00±1.25)个)?果粒数((6.52±2.67)粒)和千粒质量((5.58±1.48)g)平均值最大?7个产量相关性状的表型变异系数为11.18%~18.29%?广义遗传力从大到小依次为千粒质量>果粒数>单株粒质量>株高>单株果数>分枝数>工艺长度?群体结构K=4时，229份亚麻种质分为4个群体?30对SSR引物共扩增出365条带，与亚麻7个产量相关性状进行GLM关联分析共检测到36个SSR标记，表型变异的解释率为1.15%(Lu146)~7.75%(Lu747)；MLM关联分析共检测到23个SSR标记，表型变异的解释率为2.26%(Lu203a)~7.16%(Lu291)?在GLM和MLM下，单株粒质量?单株果数和分枝数同时检测到了Lu203a和Lua125a标记，分别分布在第12，2号染色体上?亚麻SSR标记能够很好地关联到产量相关性状，具有一定的解释率?
关键词：亚麻；产量；关联分析；SSR
亚麻(Linum usitatissimum L.)是我国特色油料作物，一般分为油用亚麻(胡麻)和纤维亚麻[1]?主要分布于我国华北?西北地区?亚麻对不同自然环境的适应能力较强，适合种植于我国北方地区干旱寒冷的生态区域?亚麻籽富含亚麻酸?木酚素?亚麻胶?膳食纤维等丰富的营养成分，有益于人体健康，可以制成多种保健食品[2]?
亚麻种质产量相关性状的表型鉴定及其关联的SSR标记的挖掘，对亚麻高产育种具有重要意义?近年来，众多学者以亚麻种质资源为研究对象，通过表型鉴定分析了亚麻产量相关性状的遗传变异?欧巧明等[3]对336份油用亚麻种质资源的6个主要农艺性状进行鉴定与评价，筛选出10份株高适中，单株分茎?分枝能力强，单株果数多，单株生产力高的品种?王利民等[4]应用主基因+多基因混合遗传分离分析方法，研究了单株产量?单株果数?千粒质量和每果粒数4个性状的遗传效应，结果表明，单株产量?单株果数?千粒质量的遗传效应相同?陈英[5]对341份亚麻种质资源的11个数量性状进行多元统计分析，发现亚麻分枝数的变异系数最大，成熟日数的变异系数最小?李秋芝等[6]通过亚麻核心种质农艺性状的遗传多样性分析，筛选出20份表现型较理想的资源材料?邓欣等[7]对535份亚麻材料的表型进行鉴定与评价，结果表明，亚麻种子产量与分枝数?分枝习性?单株茎质量?蒴果数?茎粗?分茎数?全生育日数?千粒质量呈正相关，与工艺长度?出麻率及开花日数呈负相关?
开发亚麻产量相关性状紧密连锁的遗传标记，对亚麻育种缩短周期?提高效率以及精准选育具有重要意义?产量相关性状易受环境影响，属于数量性状?关联分析是快速?准确定位目标性状基因的重要方法，是开发实用性分子标记的主要手段?Cloutier等[8]用30份EST-SSR引物对23份亚麻种质进行了遗传多样性分析?Wu等[9]采用简化基因组测序技术，在亚麻中开发出1574个SSR标记?Choudhary等[10]利用22个SSR标记的270个多态性位点与130份亚麻种质的26个表型性状进行关联分析，获得了95个显著关联位点?这些结果对亚麻种质SSR标记研究提供基础?
内蒙古自治区农牧业科学院胡麻课题组前期研究中通过对401份亚麻种质的表型和SRAP标记的评价，构建了229份亚麻核心种质的自然群体，在此基础上，本研究利用30对SSR引物对该核心群体进行基因型检测，旨在挖掘产量相关性状紧密关联的SSR标记，为亚麻遗传改良提供理论基础?
1材料和方法
1.1试验材料
供试材料为229份亚麻核心种质，其中110份为国内种质，分别来自6个亚麻主产区(内蒙古占10%?甘肃占18%?河北占6%?山西占6%?宁夏占5%?新疆占3%)，119份为国外种质，分别来自9个国家(美国占9%?荷兰占8%?匈牙利占8%?加拿大占7%?法国占5%?巴基斯坦占5%?阿根廷占3%?伊朗占3%?俄罗斯占3%)?
1.2产量相关性状的测定与分析
229份亚麻种质分别种植于内蒙古呼和浩特市(Hohhot，HS)?集宁区(Jining，JN)?锡林郭勒盟太仆寺旗(Ximeng，XM)?新疆伊犁州(Xinjiang，XJ)4个亚麻主产区，田间播种均采用随机区组设计，3次重复，每份种质材料种植3行，行长2.0m，行距0.20m，每行种子180粒?4个地区的地理位置?物候条件?播种和收获时期见表1?苗期，取2.00g新鲜嫩叶于-80℃冰箱保存备用?亚麻生理成熟后，试验小区随机取样20株，参照《亚麻种质资源描述规范和数据标准》[11]，测定株高?工艺长度?单株果数?每果粒数?单株粒质量?种子千粒质量?分枝数等性状?
表1 4个种植区的地理位置?气候条件
1.3亚麻SSR-PCR扩增
样品基因组DNA提取参照Stewart等[12]提出的CTAB法，检测合格之后于-20℃保存备用?利用本课题组前期筛选获得的30对SSR引物(表2)，送上海生工生物工程技术服务有限公司合成，PCR反应体系和扩增程序与伊六喜等[13]优化程序一致?扩增产物用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，恒功率70W电泳1.5h，采用银染法显色[14]?DNA Marker(1500)条带为对照标记种质之间基因型差异条带，标记为“0”或“1”，组成一个“1”和“0”的数据矩阵[15]?用POPGEN1.32计算有效等位基因数?引物多态性信息含量[16]；用TASSEL5.0对表型数据和SSR分子标记数据进行广义线性模型(General linear model，GLM)和混合线性模型(MLM)的关联分析，得出P值?表型变异解释率?关联位点以及表型效应值数据?
表2 30对引物序列
2结果与分析
2.1亚麻产量相关性状的统计分析
7个产量相关性状的统计分析结果表明，在4个环境下，株高平均值为(56.80±6.22)cm，其中呼和浩特地区平均值最大，为(58.40±5.67)cm；工艺长度平均值为(20.93±6.53)cm，其中新疆地区的平均值最大，为(22.30±6.90)cm；分枝数平均值为(4.63±1.03)个，其中集宁地区的平均值最大，为(5.00±1.25)个；单株果数平均值为(16.31±5.04)个，其中呼和浩特地区的平均值最大，为(17.50±3.50)个；果粒数平均值为(6.22±2.07)粒，其中集宁地区的平均值最大，为(6.52±2.67)粒；千粒质量平均值为(5.42±1.69)g，其中集宁地区的平均值最大，为(5.58±1.48)g；单株粒质量平均值为(0.52±0.20)g，其中呼和浩特地区平均值最大(0.55±0.15)g?7个产量相关性状的4个环境下的平均变异系数为11.18%~18.29%，其中分枝数变异系数最小(11.18%)，单株粒质量的变异系数最大(18.29%)?在4个环境下千粒质量的广义遗传力最大(63.25%)，工艺长度的广义遗传力最小(48.85%)，7个产量相关性状的广义遗传力从大到小依次为千粒质量>果粒数>单株粒质量>株高>单株果数>分枝数>工艺长度(表3)?对7个产量相关性状的正态分布检验结果表明，所有性状基本呈现正态分布的趋势(图1)，说明亚麻株高?工艺长度?单株果数?果粒数?单株粒质量?千粒质量?分枝数主要由基因型控制?
表3 不同环境下7个亚麻产量相关性状的统计分析
图1 229份亚麻品质(系)的7个产量相关性状的频率直方图
2.2亚麻产量相关性状的相关性分析
7个产量相关性状之间的相关性分析结果表明，除了工艺长度和千粒质量?千粒质量和株高之间呈极显著负相关，株高与工艺长度的相关系数最大，为0.863(表4)，说明亚麻株高和工艺长度是密切相关的2个性状，在纤维亚麻中该特征更为明显，此结果与前期对401份亚麻材料的表型分析结果一致[17]?亚麻单株粒质量?单株果数?果粒数和千粒质量是影响亚麻单株产量的主要性状，本研究结果表明，亚麻单株粒质量与分枝数?单株果数和果粒数之间呈极显著正相关，说明单株果数?果粒数和千粒质量的增多，可以提高单株粒质量，其是亚麻单产直接相关的因素?千粒质量与株高和工艺长度呈极显著负相关(P<0.01)，该结果进一步说明了纤维亚麻和油用亚麻之间的表型差异，纤维亚麻株高较高，但种子籽粒较小，而油用亚麻株高较矮，但种子籽粒大?
表4 亚麻7个产量相关性状间的相关性分析
2.3 SSR引物多态性分析
由表5可知，利用30对SSR引物在229份亚麻材料中共扩增出365条条带，平均每对引物扩增出12.17条条带，其中Lu462引物扩增的条带最多(19条)，多态性位点在5~19，有效等位基因数在1.1991~1.8320，引物多态性含量为0.2489~0.6257，其中Lua37引物的多态性含量最高，为0.6257，其次为Lu422引物(0.6117)，引物平均多态性含量为0.4322?本试验使用的SSR引物多态性好?条带清晰，以Lu661引物在29份亚麻种质上扩增结果为例(图2)?
表5 30对SSR引物在229份亚麻种质的扩增
图2引物Lu661在部分亚麻种质中的扩增
2.4遗传多样性分析
将229份亚麻种质划分为两大类群，分别表示为A和B(图3)，其中，A群包括116份亚麻种质，其中国内种质33份，国外种质83份?该群分为2个亚群，第1个亚群(A-Ⅰ)包括74份亚麻种质，其中国内种质20份(内蒙古9份?甘肃5份?宁夏2份?新疆2份?山西1份?河北1份)，占该亚群的27.02%；国外种质54份，占该亚群的72.98%?第2个亚群(A-Ⅱ)包括42份亚麻种质，其中国内种质13份(内蒙古8份?甘肃3份?河北1份?新疆1份)，5期伊六喜等：亚麻主要产量相关性状的SSR关联分析57占亚群的30.95%；国外种质29份，占该亚群的69.05%?B群包括113份亚麻种质，其中国内种质87份，国外种质26份?该群分为2个亚群，第1个亚群(B-Ⅰ)包括56份亚麻种质，其中国内种质45份，占该亚群的80.35%；国外种质11份(加拿大3份?美国2份?法国2份?巴基斯坦2份?西德1份?匈牙利1份)，占该亚群的19.64%?第2个亚群(B-Ⅱ)包括57份亚麻种质，其中国内种质42份，占该亚群的73.68%；国外种质15份(加拿大7份?美国3份?俄罗斯2份?匈牙利1份?法国1份?阿根廷1份)，占该亚群的26.32%?从A和B这2个大类群国内外种质占比来看，基本能区分开?对229份亚麻种质的群体结构分析结果显示，当K=4时，ΔK的值出现显著峰值(图4)，因此，当K=4时，分为4个群体，第1个群?第2个群和第4群均为56份种质，第3群为61份种质(图5)?
图3 229份亚麻种质的系统进化树
图4 ΔK随K值的变化曲线
图5 229份亚麻种质群体结构分析
2.5关联分析
使用TASSEL5.0软件的广义线性模型(GLM)58华北农学报37卷和混合线性模型(MLM)程序，将每份种质的Q值作为协变量，对30个SSR标记分别与不同环境下检测到表型数据均值进行关联分析，检测目标性状显著(P<0.01)关联的标记?GLM和MLM的关联分析结果分别见表6，7，GLM下检测到了36个SSR标记，标记对性状表型变异的解释率为1.15%(Lu146)~7.75%(Lu747)，平均为4.19%；MLM下检测到了23个SSR标记，标记对性状表型变异的解释率为2.26%(Lu203a)~7.16%(Lu291)，平均为3.62%?在GLM和MLM下，单株粒质量?单株果数和分枝数同时检测到了Lu203a和Lua125a标记，分别分布在第12，2号染色体上。
表6 亚麻产量相关性状的GLM关联分析
表7 亚麻产量相关性状的MLM关联分析
3结论与讨论
亚麻是一种高度自花授粉作物，在高产育种技术上，仍沿用常规育种手段，能用的分子标记较少，导致育种周期长，选择效率低，品种更新换代缓慢?因此，通过亚麻种质资源产量相关性状的关联分析，挖掘实用性分子标记对亚麻遗传改良具有重要意义?关联分析研究中，种质资源的表型鉴定评价是最关键的一步，利用本课题组前期构建的229份亚麻核心种质材料[18]，通过4个环境的表型鉴定分析结果表明，在呼和浩特地区种植的亚麻种质株高((58.40±5.67)cm)?单株果数((17.50±3.50)个)和单株粒质量((0.55±0.15)g)指标表现为最大；在集宁地区种植的亚麻种质分枝数((5.00±1.25)个)?果粒数((6.52±2.67)粒)和千粒质量((5.58±1.48)g)的指标表现为最大，说明不同种植环境对亚麻产量相关性状的影响较大?7个产量相关性状的变异系数为11.18%~18.29%，除千粒质量与株高和工艺长度呈极显著负相关外，其他性状之间相关性均为正相关?广义遗传力从大到小依次为千粒质量>果粒数>单株粒质量>株高>单株果数>分枝数>工艺度?基于SSR标记的遗传多样性分析结果表明，229份亚麻种质分为2个大群，国内外种质基本能区分开?此结果为亚麻种质资源收集保存和种质创新提供重要的参考信息?然而为了更好地服务亚麻育种，这些试验结果还需要多年多点的大田试验来进一步鉴定与评估?
近几年，亚麻SSR标记开发研究报道较多[19-20]，但是这些成千上万标记真正应用于亚麻育种当中的寥寥无几，因此，亚麻种业发展需要更多种质资源的表型和基因型鉴定评价，并挖掘实用性分子标记?本研究筛选出30对SSR多态性引物，共扩增出365条条带，与亚麻7个产量相关性状进行关联分析，GLM下检测到了36个显著关联的SSR标记，MLM下检测到了23个SSR标记?其中Lu203a和Lua125a标记在2种模型下均关联到单株粒质量?单株果数和分枝数?通过亚麻参考基因组(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore?LinkName)的比对，Lu203a(CCTTTTCACGCAGAGCTACC/GCTTCCGTAATCCTCTTCCA)标记分布在12号染色体上，Lua125a(GCCTTTGGAGGGCTTAACTT/ACAATCCCAACATTCCCAAA)标记分布在2号染色体上?前人对亚麻种质的SSR标记研究中大量使用了这2个标记[21-24]，说明后期可以利用Lu203a和Lua125a标记辅助选择对应的目标性状，对亚麻遗传改良提供便利?
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