摘 要:剑麻是热带地区重要的纤维作物，生产中易受到寒害威胁而造成减产。超氧化物歧化酶（SOD）是一种重要的保护酶，在植物应答低温等逆境条件胁迫过程中起重要作用。前人研究已初步明确超氧化物歧化酶在剑麻低温处理后起重要作用，但其在剑麻中的基因序列及分子调控机制尚未明确。在已发表的剑麻转录组数据库中鉴定出5个SOD基因，遗传进化分析显示其在不同植物物种中进化较保守。实时定量PCR结果显示低温胁迫后5个基因表达模式均呈先上升后下降趋势，且均与SOD活性变化显著正相关（P<0.05）。其中2个CSD基因和1个FSD基因与SOD活性极显著正相关（P<0.01），表明这3个基因在应答低温胁迫过程中起重要作用。研究鉴定了剑麻SOD基因并初步明确其应答低温胁迫表达模式，为深入开展剑麻抗寒机制研究提供了重要基础。
关键词：剑麻；超氧化物歧化酶基因；低温胁迫；基因表达
剑麻是热带亚热带地区广泛种植的硬质纤维作物，在我国主要种植于广西、广东、海南等地[1]。剑麻纤维具有强度高、质地坚韧、耐腐蚀等特性，在航海、渔业、造纸等行业用途广泛[2]。此外，剑麻纤维复合材料的高强度、耐腐蚀等特性在环保再生型建筑材料方面存在巨大的应用前景[3]。近年来随着全球气候的变化，极端温度（高温和低温）出现频次日益增多，已成为制约全球农业进一步发展的重要因素[4]。低温作为一种非生物胁迫，可造成植物组织冻伤，引起芽萎缩、叶片发黄萎蔫、组织死亡等寒害症状[5]。剑麻作为典型的热带作物之一，对低温寒害耐受力较差。我国大部分剑麻种植区处于热带亚热带地区，在早春易受“倒春寒”影响，严重时可造成大面积减产[6]。目前拟南芥、水稻等模式植物中已开展了大量的低温胁迫调控机制相关研究，而剑麻相关研究报道较少。张学财等[7]测定了低温胁迫后剑麻叶片中保护酶等生理指标的变化规律，黄显雅等和田夏红等分别开展了剑麻种质资源抗寒性田间调查[4,8]。杨欣丽开展了剑麻应答低温胁迫机制研究，明确了8种生理生化指标及CBF、psaA和psaB等基因的变化规律[6]。超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD）作为一种重要的保护酶，可有效清除植物体内过量的活性氧，在植物生长发育、逆境胁迫应答等过程中起重要作用[9]。剑麻中已初步明确低温胁迫后SOD活性变化，但相关基因及表达模式尚未报道[6,7]。本研究根据已发表的剑麻转录组，通过同源序列比对鉴定SOD基因，并开展系统进化及表达分析，阐明剑麻SOD基因的遗传进化规律及其应答低温胁迫表达模式，为探明其生物学功能及作用机制提供基础。
1 材料与方法
1.1 材料种植与处理
本研究选取的试验材料为剑麻主栽品种‘H11648’株芽苗，在中国热带农业科学院环境与植物保护研究所（19.99°N，110.33°E）盆栽种植2个月后放置于智能人工气候培养箱（DRXM-150-2，上海川昱）进行低温处理。6°C处理0h、6h、12h、18h、24h时剪取叶片取样[6]，每个处理均在不同植株重复取样3次，随后置于液氮速冻，放置于-80°C超低温冰箱保存备用。
1.2 材料种植与处理
以7个拟南芥和7个水稻SOD基因为参考序列，通过TBlastx方法在剑麻转录组数据库检索SOD基因同源序列[10-13]。通过ORF-FINDER软件分析检索获得的剑麻基因序列，将包含完整编码序列的SOD基因进行后续分析[14]。通过ProtParam软件在线预测剑麻SOD蛋白长度、分子量和理论等电点等理化性质[15]。选取拟南芥（7个）、水稻（7个）、芦笋（9个）和剑麻（5个）SOD蛋白序列在ClustalX2.0软件中进行多重序列比对，进而构建Neighbor-Joining系统进化树，Bootstrap分析重复1000次[16]。
1.3 剑麻SOD基因表达分析及SOD活性测定
采用天根植物总RNA提取试剂盒（天根生化科技，中国）提取样品中的总RNA，并通过Go Script Reverse Transcription System（Promega,美国）反转录为cDNA备用。通过QuantStudio6实时荧光定量PCR系统（赛默飞，美国）进行实时定量PCR分析。PCR反应程序为94℃反应30s；94℃反应3min，94℃反应10s，58℃反应30s，共重复40个循环；溶解曲线循环。PCR扩增体系最终体积为20μL，其中包含1μLc DNA模板、10μL Trans Start Tip Green qPCR Super mix（全式金，中国）、0.4μL Passive Reference Dye（全式金，中国）、0.5μL正向引物、0.5μL反向引物和7.6μ双蒸水。根据5个剑麻SOD基因及内参基因PP2A（proteinphosphatase2A）的编码序列，在Primer3软件中设计定量PCR引物，其序列见表1[17]。每个样品重复3次作为技术重复，通过2-ΔΔCt法计算每个基因的相对表达量[18]。采用羟胺法测定剑麻样品中SOD活性[6]。
2 结果与分析
2.1 剑麻SOD基因的鉴定
在剑麻转录组中进行同源序列检索共获得5个含完整编码序列的SOD基因（表2），将其命名为AhCSD1、AhCSD2、AhMSD1、AhFSD1和AhFSD2，其序列长度为834～1397bp，编码的蛋白质长度为152～300aa。蛋白质分子量为15225.84～33921.87Da，理论等电点为5.07～8.84。
表1 实时定量PCR引物
表2 剑麻SOD基因及其蛋白理化性质
图1 拟南芥、水稻、芦笋及剑麻SOD基因遗传进化分析
注：At表示拟南芥；Ah表示剑麻；Ao表示芦笋；Os表示水稻
2.2 剑麻SOD基因系统进化分析
以拟南芥、水稻SOD基因为参照，选取天门冬目作物芦笋、剑麻SOD基因进行遗传进化分析。利用ClustalX2.0软件进行氨基酸序列的多重比对并构建Neighbor-Joining进化树（Bootstrap分析采用1000次重复），结果如图1所示。28个蛋白序列被分成3个分支，即FSD、MSD和CSD分支。FSD和MSD分支中各物种序列数相近，拟南芥和芦笋序列数分别在两分支多于其他物种。CSD分支中水稻和芦笋序列数多于拟南芥和剑麻，其中CSD3亚分支中未聚类到剑麻序列。此外，剑麻和芦笋序列均聚类在相同分支。
2.3 剑麻SOD基因应答低温胁迫表达分析
通过实时定量PCR检测低温胁迫后剑麻SOD基因表达模式，结果显示5个基因表达水平均呈先上升后下降趋势，但未达到显著水平（图2）。其中AhFSD2表达水平在处理后12h和24h时分别较6h和18h时略有下降，其余4个基因表达水平仅在处理后24h略有下降。
2.4 剑麻低温胁迫SOD活性与基因表达相关性分析
进一步测定了低温胁迫后剑麻叶片中SOD活性，结果显示其呈先上升后下降趋势，处理后18h时SOD活性达到峰值后下降（图3A）。将SOD活性与5个基因的表达模式进行相关性分析（图3B），结果显示AhFSD1、AhFSD2和AhCSD1表达模式与SOD活性呈极显著正相关（P<0.01），其余2个基因呈显著正相关（P<0.05）。
图2 剑麻SOD基因低温胁迫表达模式
A：样品叶片中SOD活性图 B：SOD与基因表达相关性分析图
图3 剑麻SOD基因低温胁迫表达模式
注：B中R为相关系数，*和**分别表示显著（P<0.05）和极显著（P<0.01）
3 讨论
SOD在植物抗氧化防御系统中起重要作用，可将超氧阴离子自由基歧化为H2O2和O2以清除活性氧[19]。剑麻中已初步明确SOD在应答低温胁迫过程中起重要作用，但其蛋白类型及基因序列尚未明确[6]。植物中主要存在3种类型SOD，即CSD（Cu/Zn-SOD）、MSD（Mn-SOD）和FSD（Fe-SOD），高等植物中以CSD为主[20]。根据同源序列检索发现剑麻中存在上述3种类型SOD基因，在不同植物物种中进化较保守，与模式植物相比CSD基因数量较少，可能与SOD基因的组织特异性表达有关[11]。目前剑麻基因组序列尚未公布，叶片转录组数据中可能并未完全反映基因组水平SOD基因家族的表达模式。实时定量PCR结果显示低温处理后5个剑麻SOD基因表达水平均上升，在24h时开始下降，与SOD活性变化规律一致，且均呈显著正相关，表明5个基因均参与应答低温胁迫。其中2个CSD基因和1个FSD基因与SOD活性极显著正相关，表明这3个基因在应答低温胁迫过程中起重要作用。后续将进一步探究剑麻CSD基因应答低温胁迫机制，提升对剑麻抗寒机制的理解，对选育抗寒剑麻新品种具有重要意义。
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文章摘自: 陈莉莎，李玉波，胡晓丽，杨欣丽，易克贤，黄兴. 剑麻超氧化物歧化酶基因鉴定及低温胁迫表达分析[J]. 中国热带农业，2024，116(01):23-27.
