摘 要:为明确汉麻不同花和叶的挥发性成分，以品种brosom为材料，利用顶空-气相色谱/质谱联用技术对其雌花、雄花、雌株老嫩叶、雄株老嫩叶的挥发性成分进行测定。结果表明，相对含量在0.05%以上的挥发性成分中，雌花检测到36种、雄花23种、雌株老叶32种、雌株嫩叶35种、雄株老叶26种、雄株嫩叶30种；萜烯类是花、叶的主要挥发性成分，其中单萜类是雌/雄花的优势成分，雌花主要成分为β-蒎烯和D-柠檬烯，雄花为α-蒎烯、β-蒎烯和D-柠檬烯；倍半萜类是雌株老/嫩叶优势成分，单萜类是雄株老/嫩叶优势成分；雌株老叶主要成分为β-蒎烯、D-柠檬烯、石竹烯和叶醇，雌株嫩叶为D-柠檬烯、石竹烯和β-金合欢烯，雄株老叶为α-蒎烯、β-蒎烯、石竹烯和叶醇，雄株嫩叶为α-蒎烯和β-蒎烯。挥发性成分相似率分析结果显示，雌花和雄花相似率较高，雌株老/嫩叶及雄株老/嫩叶相似率极高，而不同性别的花、叶间相似率较低。雄株老嫩叶α-蒎烯含量（>44.84%）显著高于雌株老嫩叶（<2.65%），雌株老嫩叶的β-金合欢烯含量（>9.18%）显著高于雄株老嫩叶（<0.33%），故α-蒎烯和β-金合欢烯可作为区分brosom雌/雄株的挥发性成分标识物。α-蒎烯、石竹烯、β-罗勒烯在雌/雄花中的差异表现丰富了汉麻雌/雄花在挥发性成分方面的基础知识。本研究结果为汉麻育种及其综合开发利用提供了理论基础。
关键词：汉麻；花；叶片；挥发性成分；顶空-气相色谱/质谱联用
汉麻（China-Hemp），别名工业大麻，为大麻科（Cannabinaceae）大麻属（Cannabis）一年生草本植物，其四氢大麻酚（tetrahydrocannabinol，THC）含量低于0.3%，属于无毒品利用价值大麻类型，被用于纺织、造纸、军需、生物能源、食品保健、医药、化妆品、饲料和油料等[1-5]。汉麻起源于东亚[6]，目前在我国黑龙江、云南、甘肃、吉林等地均有栽培[7]。汉麻一般为雌雄异株，雄株开花不结籽，雌株授粉后即可结籽，经过选育也有雌雄同株[8]。但现蕾开花前，难以辨别雌/雄株，对汉麻育种带来一定困扰。在生长旺盛时期和后期，汉麻叶占整个植株质量分别为25%和8%~14%[9]，其具有丰富的萜类、酚类、黄酮类、生物碱等生理活性成分[10-12]。汉麻花、叶具有镇痛、止痛、降眼压、抗肿瘤、抗呕吐、抗紫外线和抗菌消炎等多种功能活性[13-14]。
Fiorini等[15]在汉麻干花序中获得了一种富含大麻二酚（cannabidiol，CBD）的精油，但未对汉麻雌/雄花序的挥发性成分进行相关研究。关于汉麻叶片挥发性成分的研究报道较多，如蒋勇等[16]采用同时蒸馏萃取-气相色谱-质谱联用分析云南一号汉麻叶挥发性成分，共检出44种挥发性成分；朱晨瑜等[11]采用顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用技术分析云南一号汉麻叶挥发性成分，共检出59种挥发性成分。但关于其不同部位（雌/雄株的老/嫩叶）叶片挥发性成分研究鲜见报道。本研究以汉麻雌/雄株的花序、老/嫩叶为试材，采用顶空-气相色谱/质谱联用（headspace-gas chromatography/mass spectrometry，HS-GC/MS）技术检测不同性别花和不同生理状态叶中的挥发性成分，旨在筛选出汉麻不同花、叶的主要活性成分并明确其主要特征，为汉麻育种及开发利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料和仪器
以福建省农业科学院亚热带农业研究所汉麻种质资源圃保存的品种brosom为试材，采集雌/雄株的花序、老叶（植株中下部）、嫩叶（植株中上部），每个样品由多个单株混合置于封口袋。
TriPlus300顶空自动进样器和Trace1300-TSQ9000气质联用仪器，美国赛默飞世尔科技公司；JS39D-250多功能食品加工机-搅拌机，浙江苏泊尔生活电器有限公司。
1.2 试验方法
分别将鲜花序和搅拌机搅碎后的叶片称取3g置于20mL的顶空螺纹瓶（设3个平行重复），待测。顶空条件、气相条件和质谱条件参照林宝妹等[17]的方法，并稍作改动，其中腔温100℃、炉温90℃，瓶静态平衡时间5min。升温程序中以10℃·min-1升温到290℃，保持3min，总时间为43min。
定性和定量分析参照林宝妹等[17]的分析方法。成分相似率分析参照王华夫等[18]的计算方法，分析、比较汉麻不同部位花叶挥发性成分的相似性和差异性。
1.3 数据分析
采用SPSS22.0统计软件进行单因素方差分析，采用Excel2007制作图表。
2 结果与分析
2.1 花的挥发性成分组成
从brosom汉麻雌/雄花中共检测出相对含量在0.05%以上的化合物有45种，包括雌花含36种、雄花含23种，其中共有成分14种。花的挥发性成分包含萜烯类、酯类、醇类和酮类四大类，雌花包含4类，雄花包含2类。雌/雄花均以萜烯类化合物为主体成分，分别含30、20种化合物，含量分别为96.31%、97.99%，雌花醇类含量（2.40%）显著高于雄花（0.26%，P<0.05），雄花未检测到酯类和酮类。萜烯类物质由单萜类和倍半萜类构成，雌/雄花的倍半萜烯类物质组成个数均多于单萜类，但单萜类物质为花的优势成分，其含量极显著高于倍半萜（P<0.01），雄花中单萜类化合物含量（93.20%）显著高于雌花（68.55%，P<0.05），雌花中倍半萜类含量（27.77%）显著高于雄花（4.80%，P<0.05）。
表1可知，brosom汉麻雌/雄花主要挥发性成分组成及含量差异较大，将在样品中出现含量大于10%的主要成分进行分析。雌花挥发性成分主要由单萜类的β-蒎烯（35.96%）和D-柠檬烯（18.47%）组成，占总挥发性成分含量的54.92%；雄花挥发性成分主要由单萜类的α-蒎烯（33.20%）、β-蒎烯（44.51%）和D-柠檬烯（13.93%）组成，占总挥发性成分含量的93.26%，β-蒎烯是雄花的绝对优势成分。
表1 汉麻花的主要挥发性成分及其相对含量
注：同行不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。“-”表示不存在或未检测到。下同。
2.2叶片的挥发性成分组成
由表2可知，叶片中挥发性成分包含萜烯类、酯类、醇类、酮类和醛类五大类，雌株老叶含四大类，雌株嫩叶、雄株老叶、雄株嫩叶含三大类。与花相似，4个部位叶片均以萜烯类化合物为主体成分，含20~28种化合物，且以雌株嫩叶含量（88.20%）最高。雌/雄株老叶酯类化合物含量均比嫩叶高，其中以雌株老叶（0.60%）最高，显著高于其他3个部位。醇类化合物含量以雄株嫩叶（15.41%）最高，酮类化合物含量以雌株老叶（0.18%）最高，醛类化合物仅在雄株嫩叶中（0.16%）检测到。
从brosom汉麻雌株老/嫩叶、雄株老/嫩叶4个部位的叶片中共检测出相对含量在0.05%以上的化合物54种，其中，雌株老叶32种，雌株嫩叶35种，雄株老叶26种，雄株嫩叶30种，共有成分15种。由表3可知，brosom汉麻雌/雄株老/嫩叶主要挥发性成分组成及含量差异较大，分析在样品中出现含量大于10%的主要成分发现，雌株老叶主要挥发性成分由单萜类的β-蒎烯（16.56%）和D-柠檬烯（15.30%）、倍半萜类的石竹烯（15.16%）和醇类物质叶醇（13.10%）构成，占总挥发性成分含量的61.40%。雌株嫩叶主要成分由单萜类的D-柠檬烯（12.99%）和倍半萜类的石竹烯（21.94%）、β-金合欢烯（10.52%）构成，倍半萜类含量优势明显高于单萜类。雄株老叶主要挥发性成分由单萜类的α-蒎烯（44.84%）和β-蒎烯（12.15%）、倍半萜类的石竹烯（10.31%）和叶醇（10.62%）构成，占总挥发性成分含量的79.07%，单萜类含量优势明显高于倍半萜类，α-蒎烯是雄株老叶的绝对优势成分。雄株嫩叶主要挥发性成分由单萜类的α-蒎烯（46.25%）和β-蒎烯（12.78%）构成，与雄株老叶相似，单萜类含量优势明显高于倍半萜类，α-蒎烯是雄株嫩叶的绝对优势成分；α-蒎烯方面，雄株老叶（44.84%）、雄株嫩叶（46.25%）显著高于雌株老叶（2.65%）、雌株嫩叶（2.29%）；β-金合欢烯方面，雌株老叶（9.18%）、雌株嫩叶（10.52%）显著高于雄株老叶（0.28%）、雄株嫩叶（0.33%）（P<0.05）。可见，α-蒎烯和β-金合欢烯可以作为区分该品种雌/雄株的挥发性成分。
brosom汉麻4个部位的叶片挥发性成分萜烯类组成及其含量差异明显（表4）。与花相似，叶片4个部位的倍半萜烯类组成个数均多于单萜类；雌株老/嫩叶萜烯类物质以倍半萜为优势成分，雄株老/嫩叶萜烯类物质以单萜类为优势成分，其含量极显著高于倍半萜（P<0.01）。雌株嫩叶倍半萜含量（59.24%）显著高于雌株老叶、雄株老叶和雄株嫩叶（P<0.05），以雄株老叶中单萜类化合物含量（66.66%）最高。
表2 汉麻花和叶的主要挥发性成分类型及其相对含量
表3 汉麻叶片的主要挥发性成分及其相对含量
表4 汉麻花和叶的萜烯类物质组成及其相对含量
注：同列不同小写字母表示部位间差异显著（P<0.05）；**表示同一部位单萜类与倍半萜类在P<0.01水平差异极显著。
2.3 花、叶挥发性成分相似率
由表5可知，brosom汉麻雌花与雄花的挥发性成分相似率较高，达到0.840。雌株老叶与嫩叶、雄株老叶与嫩叶挥发性成分相似率极高，分别为0.946、0.988。雌株老/嫩叶与雄株老/嫩叶之间的挥发性成分相似率较低，为0.349~0.467。雌花与雌株老/嫩叶（0.810、0.664）、雄花与雄株老/嫩叶（0.761、0.757）的挥发性成分相似度较高，雌花与雄株老/嫩叶（0.456、0.416）、雄花与雌株老/嫩叶（0.563、0.390）的挥发性成分相似度较低，说明brosom不同类型花、叶挥发性成分既有相似性又有差异性。
表5 汉麻花叶挥发性成分相似率
3 讨论
植物挥发性成分主要由萜烯类、苯丙酸类/苯环型化合物和脂肪族化合物构成，其中萜烯类化合物主要由单萜烯和倍半萜烯构成[19-20]，香气淡、雅、幽，最常见的化合物有α-蒎烯、β-蒎烯、柠檬烯、罗勒烯、石竹烯、金合欢烯等[21]，具有抗氧化、抗病毒、消炎、止咳、镇痛等重要生理作用[22]。食用菊花[23]、树葡萄花[24]、石斛花[25]等植物花朵均以萜烯类物质为优势成分。南瓜雌花主要挥发性成分比雄花多，且雄花以萜烯类为主[26]；苯甲醇、芳樟醇、α-金合欢烯在栝楼雌/雄花中有显著差异[27]，表明雌雄异株植物的花挥发性成分存在特征性差异。本研究中雌花和雄花挥发性成分均以单萜类为优势成分，主要包括α-蒎烯、β-蒎烯、D-柠檬烯、β-罗勒烯等，与大多植物花香较为一致。α-蒎烯在雄花中的含量（33.20%）显著高于在雌花中的含量（5.76%），平均相对含量之比为5.76∶1，石竹烯（8.90%）、β-罗勒烯（7.54%）、β-金合欢烯（4.90%）、顺式-α-柑油烯在雌花中的含量（3.79%）显著高于雄花中的含量（1.89%、0.23%、0.06%、0.25%），平均含量之比分别为4.71∶1、32.7∶1、81.67∶1和15.16∶1，可见，同一成分在雌/雄花中存在显著差异，丰富了汉麻雌雄异株的基础研究。
与雌/雄花相似，brosom汉麻雌/雄株老嫩叶挥发性成分种类和相对含量也存在相似性和差异性。有研究报道，挥发性成分可作为识别或标志物，如α-檀香醇和β-檀香醇等5个主要挥发性成分可用于檀香产地识别[28]，乙酸乙酯和苯乙酸乙酯等可作为浓香型白酒基酒等级识别物质[29]。本研究中雄株老/嫩叶的α-蒎烯含量显著高于雌株老/嫩叶，雌株老/嫩叶的β-金合欢烯含量显著高于雄株老/嫩叶，说明在该品种雌/雄株未现蕾开花前，α-蒎烯和β-金合欢烯可作为区分雌雄株的标识成分，为汉麻育种提供了研究基础。朱晨瑜等[11]研究表明，汉麻叶主要挥发性成分是[1R-（1R*，4Z，9S*）]-4，11，11-三甲基-8-亚甲基-二环[7.2.0]4-十一烯、（1α，3α，5α）-1，5-二甲基-3-甲基-2-亚甲基环己烷、α-石竹烯等，以倍半萜烯为优势成分。蒋勇等[16]研究也表明，汉麻叶中主要挥发性物质为倍半萜的石竹烯和α-石竹烯。本研究中，汉麻雌株老/嫩叶的主体成分也均为倍半萜烯，但主要挥发性成分为β-蒎烯、D-柠檬烯、石竹烯、β-金合欢烯、叶醇等，与前人测定的汉麻叶片存在明显不同，这与品种特性、生长环境等密切相关。例如，邱珊莲等[30]研究发现，9个嘉宝果品种间老/嫩叶挥发性成分存在差异，老叶挥发性成分主要为α-蒎烯、β-蒎烯、α-芹子烯，嫩叶则为β-蒎烯、α-蒎烯、β-石竹烯。田媛等[31]发现汉麻叶片的石竹烯含量（19.56%）最高，与本研究中雌株嫩叶含量（21.94%）较接近。石竹烯具有抗炎、镇痛、神经保护、抗肿瘤、防治肝损伤等作用[32-33]，本研究中的汉麻4个部位叶片均可作为石竹烯的良好来源。
4 结论
汉麻brosom不同部位花叶挥发性成分均以萜烯类为主，其中单萜类是雌/雄花的优势成分，雌花主要成分为β-蒎烯和D-柠檬烯，雄花则为α-蒎烯、β-蒎烯和D-柠檬烯。倍半萜类是雌株老/嫩叶优势成分，单萜类是雄株老/嫩叶优势成分，雌株老叶主要成分为β-蒎烯、D-柠檬烯、石竹烯和叶醇，雌株嫩叶为D-柠檬烯、石竹烯和β-金合欢烯，雄株老叶为α-蒎烯、β-蒎烯、石竹烯和叶醇，雄株嫩叶为α-蒎烯和β-蒎烯，其中雄株老嫩叶α-蒎烯含量显著高于雌株老嫩叶，雌株老嫩叶的β-金合欢烯含量显著高于雄株老嫩叶，α-蒎烯和β-金合欢烯可以作为区分该汉麻品种雌雄株的挥发性成分。雄株嫩叶中醇类含量最高，雌花和雄花相似率较高，雌株老/嫩叶及雄株老/嫩叶相似率极高，不同性别的花、叶相似率较低。
[1] Liu H L，Zhang B，Huang J C，Tian K P，Shen C. Prospects of blockchain technology in China’s industrial hemp industry[J]. Journal of Natural Fibers，2023，21（1）：2160406
[2] Zhou Q，Huang F H，Chang Z，Guo P M，Li W L，Liu C S，Wan CY. Physicochemical properties and volatile components of hempseed oils in Bama region[J]. Oil，Crop Science，2017，2（1）：13-22
[3] 闫佳佳，万璐，姜硕，许哲祥，郑春英. 汉麻叶黄酮成分及其抑菌活性分析[J]. 中国调味品，2020，45（12）：59-62
[4] Frassinetti S，Moccia E，Caltavuturo L，Gabriele M，Longo V， Bellani L，Giorgi G，Giorgetti L. Nutraceutical potential of hemp（Cannabis sativa L.）seeds and sprouts[J]. Food Chemistry，2018， 262（1）：56-66
[5] Marchetti L，Brighenti V，Rossi M C，Sperlea J，Pellati F，Bertelli
D. Use of 13C-qNMR spectroscopy for the analysis of non-psychoactive cannabinoids in fibre-type Cannabis sativa L.（Hemp）[J]. Molecules， 2019，24（6）：1138-1149
[6] Ren G P，Zhang X，Li Y，Kate R，Martha S S，Yang Y Z，Liu A， Gudasalamani R，Ali M N，Samad M A，Nicolas S，Luca F. Large- scale whole-genome resequencing unravels the domestication history of Cannabis sativa L[. J]. Science Advances，2021，7（29）：1-12
[7] 张际庆，陈士林，尉广飞，宁康，王超群，王磊，陈华，董林林.高大麻二酚（CBD）含量药用大麻的新品种选育及生产[J]. 中国中药杂志，2019，44（21）：4772-4780
[8] 韩喜财，王晓楠，姜颖，韩承伟，赵越，曹焜，张晓燕，孙宇峰，李振伟. 雌雄同株工业大麻新品种“汉麻4 号”选育[J]. 中国麻业科学，2020，42（1）：1-5
[9] 杜军强，何锦风，何聪芬，蒲彪，李靖宇，蒋勇. 汉麻叶活性成分及其药理特性的研究概况[J]. 中国医药导报，2011，8（31）：9-11
[10] Elsohiy M A， Radwan M M， Gul W. Phytocannabinoids[M].Berlin：Springer International Publishing，2017：1-36
[11] 朱晨瑜，曹蕊，蒋勇，祝钧，何聪芬，何锦风. 顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用分析汉麻叶挥发性成分[J]. 北京工商大学学报（自然科学版），2012，30（4）：44-49
[12] 张旭，孙宇峰，崔宝玉，高宝昌，田媛，石雨. 超临界CO2 萃取汉麻3 种大麻酚工艺及其抑菌性研究[J]. 化学试剂，2019，41（4）：415-420
[13] 刘雪强，刘阳，粟建光，孙宇峰. 中国汉麻综合利用技术与产业化进展[J]. 中国麻业科学，2019，41（6）：283-288
[14] 梁欣蕊，刘志华，孙立秋，王丹，时志春，李军，王金兰，赵明，张树军. 汉麻花叶化学成分研究[J]. 齐齐哈尔大学学报（自然科学版），2021，37（2）：79-81，87
[15] Fiorini D，Scortichini S，Bonacucina G，Greco N G，Mazzara E，Petrelli R，Torresi J，Maggi F，Cespi M. Cannabidiol-enriched hemp essential oil obtained by an optimized microwave-assisted extraction using a central composite design[J]. Industrial Crops Products，2020，154：112688
[16] 蒋勇，李靖宇，杜军强，何锦风，何聪芬，祝钧. 同时蒸馏萃取-气相色谱- 质谱联用分析汉麻叶挥发性成分[J]. 食品科学，2011，32（20）：226-229
[17] 林宝妹，邱珊莲，郑开斌，吴妙鸿，洪佳敏，张帅. 不同品种番石榴花的挥发性成分分析[J]. 热带亚热带植物学报，2023，31（1）： 128-140
[18] 王华夫，李名君，刘仲华，王增盛，施兆鹏. 茯砖茶在发花过程中的香气变化[J]. 茶叶科学，1991，11（S1）：81-86
[19] Hanson J R. Natural products： The secondary metabolites[J].Phytochemistry，2003，14（66）：1746
[20] 陈艺荃，林兵，钟淮钦，樊荣辉. 不同杂交兰品种花朵挥发性成分分析[J]. 中国细胞生物学学报，2019，41（10）：1901-1908
[21] 李海燕，李火根，杨秀莲，岳远征，徐晨，丁文杰，王良桂. 植物花香物质合成与调控研究进展[J]. 分子植物育种，2018，16（1）： 123-129
[22] 李一澍，姚逸萍，黄和强，陈杉彬，赵文梅，杨海存，王德良，郝飞克. 萜烯类化合物基于细胞自噬的初步探究[J]. 食品与发酵工业，2022，48（16）：42-49
[23] 陈志星，杨敏，赵娅红，姚茹瑜，刘敏荣，薛建平，黄飞燕，方宇，王启宇，余磊. SPME-GC/MS 联合分析法测定食用菊花花朵挥发性成分研究[J]. 食品研究与开发，2020，41（17）：161-165
[24] 邱珊莲，林宝妹，吴妙鸿，洪佳敏，郑开斌. 3 个嘉宝果品种花果香气成分研究[J]. 浙江大学学报（农业与生命科学版），2021， 47（6）：757-767
[25] 夏科，蒋柏生，赵志国，范进顺，文桂喜，李菲，高丽梅，蒋巧媛，仇硕. 桂林地区不同桂花品种花香成分比较分析[J]. 广西植物，2018，38（11）：1493-1504
[26] 李昌勤，卢引，李新铮，邢晗，康文艺 . HS-SPME-GC-MS 分析甜面大南瓜花挥发性成分[J]. 食品工业科技，2012，33（16）： 151-152，156
[27] 孙文，巢志茂，王淳，吴晓毅，谭志高 . HS-SPME-GC-MS 技术对栝楼雌、雄花挥发性成分的差异研究[J]. 中国中药杂志， 2012，37（11）：1570-1574
[28] 晏婷婷，陈媛，尚丽丽，王茜，李改云. 不同产地檀香木心材挥发性化学成分比较及识别[J]. 木材工业，2019，33（4）：18-21，26
[29] 周轩. 浓香型白酒基酒挥发性成分分析及等级识别研究[D]. 镇江：江苏大学，2019
[30] 邱珊莲，林宝妹，吴妙鸿，洪佳敏，郑开斌. 不同品种和生长期嘉宝果叶片酚类及挥发性物质研究[J]. 核农学报，2022，36（10）： 1996-2008
[31] 田媛，孙宇峰，张旭，高宝昌，张正海，石雨，董艳. 响应面法优化微波辅助水蒸气蒸馏法提取汉麻叶精油工艺[J]. 化学试剂， 2020，42（8）：995-999
[32] Yang M，Lv Y J，Tian X C，Lou J，An R D，Zhang Q，Li M H，Xu L，Dong Z. Neuroprotective effect of β -caryophyllene on cerebral ischemia-reperfusion injury via regulation of necroptotic neuronal death and inflammation：In vivo and in vitro[J]. Front Neurosci，2017，11：583
[33] 刘京东，陈莎，王钰淳，刘胜伟，饶江燕，王倩，邓玲，王萱，董志. β-石竹烯作用于Notch1/NF-KB 信号轴对脑缺血再灌注损伤大鼠的改善作用[J]. 第三军医大学学报，2021，43（3）：218-225
文章摘自: 练冬梅，姚运法，李洲，吴松海，洪建基. 汉麻花和叶挥发性成分分析[J].核农学报,2024，38（2）：0308-0316
