摘 要：采用8种不同方法提取火麻籽壳多酚，通过对比不同提取方法的提取率与提取物抗氧化活性，筛选出火麻籽壳多酚的最佳提取方法。采用大孔树脂对最佳提取工艺的多酚粗提物样品进行纯化，确定其纯化条件。结果表明：超声波辅助醇提法多酚提取率最高，多酚提取率为2.34mg/g。不同提取方法所得多酚提取液对DPPH·和ABTS+·都有清除能力，其中超声波辅助醇提法所得样品在不同浓度水平均表现出较强的自由基清除能力。纯化火麻籽壳多酚的最佳树脂为X-5，其吸附率和解吸率分别为74.5%和44.5%，乙醇解吸液浓度为90%。纯化后多酚对DPPH·和ABTS+·的清除能力与样品浓度之间存在量效关系，其IC50值分别0.38mg/mL和0.10mg/mL，纯化后的火麻籽壳多酚具有较高的抗氧化活性。
关键词：火麻籽壳；多酚；提取工艺；分离纯化；抗氧化性
植物多酚（plant polyphenol）又称植物单宁，具有多元酚结构，分为水解单宁和缩合单宁，是一类复杂的酚类次生代谢物[1]，常存在于天然可食性植物中，如茶叶、桑葚、豆制品、葡萄酒、果蔬等。近年来，对于植物多酚的开发应用层出不穷，采用不同工艺条件提取香菇[2]、樱桃李[3-4]、菠萝皮渣[5]、菠萝蜜果皮[6]以及铁皮石斛渣[7]等多种植物的多酚类化合物并初步探讨其生物学活性，证明植物多酚具有清除自由基、抗氧化、美白等功效。研究表明，植物多酚还具有防辐射[8]、抗癌[9]、抗过敏[10]、抑菌抗炎及增强免疫力[11]等功能，植物多酚的深入研究为食品添加剂、功能性食品、化妆品、抗氧化剂等领域提供了理论基础和技术支撑。
火麻（Cannabis sativa L.），别称汉麻、大麻、线麻等，是一种一年生的桑科、大麻属草本植物，在中国各个省份和地区都可以人工栽植，至今已有3000多年的种植历史[12-13]。从古至今，火麻在人们的日常生活中都占据着重要的位置，如纺织麻布、制作绳索、纺线、造纸或者编织渔网等[14]；火麻籽的平均含油量为30%，不饱和脂肪酸含量较高，具有显著的抗辐射与抗氧化功效[15]。
火麻籽壳是火麻籽的外壳，其质量约占火麻籽总质量的40%。在火麻籽食品（火麻籽油、火麻仁蛋白等）加工业中，火麻籽壳作为废弃物，是火麻籽食品加工生产过程中需要完全除去的部位。然而，火麻籽壳中还包含植物性纤维素、植物多酚以及少量没有去除干净的火麻籽仁等有效成分[16]。若将该产品作为原料加工后的废物丢弃，不仅是对生物质资源的巨大浪费，还会对环境造成污染。因此，本研究以火麻籽壳为研究对象，采用不同方法对火麻籽壳多酚类化合物进行提取，并对不同提取方法所得产物的体外抗氧化性进行测定，筛选提取火麻籽壳多酚的最佳提取方法，并利用大孔树脂进行初步纯化，确定纯化工艺，为火麻籽壳的开发应用提供理论参考。
1材料与方法
1.1材料与试剂
火麻籽壳：山西宏田嘉利农业科技有限公司；福林-酚（Folin-phenol）、没食子酸、抗坏血酸（均为标准品）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；1，1-二苯基-2-苦基肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、2，2'-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐[2，2'-azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid ammonium salt），ABTS]、甲醇、乙醇（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
D101、D201、NKA、HP-20和X-55种不同型号大孔树脂：北京索莱宝科技有限公司，均为乳白色不透明球状颗粒，全多孔吸附型树脂，具体参数如表1所示。
表1 5种大孔树脂参数
1.2仪器与设备
4500A高速多功能摇摆粉碎机：浙江省永康市红太阳机电有限公司；G-36A超声波清洗机：深圳市歌能清洗设备有限公司；WFG-7200分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司。
1.3方法
1.3.1提取工艺
1.3.1.1超声波辅助提取
超声波辅助醇提法（UE）：称取10g火麻籽壳粉末与70%乙醇[料液比1∶10（g/mL）]置于锥形瓶中，在温度为50℃的条件下进行超声波辅助提取40min，得到的提取液在低速离心机中以5000r/min离心15min后进行抽滤、旋蒸，并将提取样品进行冷冻干燥、保存。
超声波辅助水提法（UW）：提取物溶剂为水溶液，其他的操作步骤、条件同超声波辅助醇提法。
1.3.1.2冷浸提取
冷浸醇提法（CE）：称取10g火麻籽壳粉末与70%乙醇[料液比1∶10（g/mL）]置于锥形瓶中，在常温条件下浸泡24h（每隔30min摇晃1次锥形瓶，尽量使其完全反应），得到的提取液在低速离心机中以5000r/min离心15min后进行抽滤、旋蒸，并将提取样品进行冷冻干燥、保存。
冷浸水提法（CW）：提取物溶剂为水溶液，其他的操作步骤、条件同冷浸醇提法。
1.3.1.3热回流提取
热回流醇提法（HE）：称取10g火麻籽壳粉末与70%乙醇[料液比1∶10（g/mL）]置于锥形瓶中，在80℃条件下进行热回流提取80min，得到的提取液在低速离心机中以5000r/min离心15min后进行抽滤、旋蒸，并将提取样品进行冷冻干燥、保存。
热回流水提法（HW）：提取物溶剂为水溶液，其他的操作步骤、条件同热回流醇提法。
1.3.1.4索氏提取
索氏醇提法（SE）：称取10g火麻籽壳粉末，用滤纸包装好置于索氏提取器中，不可超过虹管长度，然后与70%乙醇进行索式提取3h，温度为100℃，得到的提取液在低速离心机中以5000r/min离心15min后进行抽滤、旋蒸，并将提取样品进行冷冻干燥、保存。
1.3.1.5高温高压提取
高温高压水提法（TW）：于500mL锥形瓶中，称取火麻籽壳粉末25g，加入250mL蒸馏水，以硫酸纸封口，置于高压灭菌器中，在121℃、0.15MPa的条件下提取20min，得到的提取液在低速离心机中以5000r/min离心15min后进行抽滤、旋蒸，并将提取样品进行冷冻干燥、保存。
1.3.2多酚提取率测定
采用福林-酚比色法[17]测定多酚得率。在10mL试管中，依次加入1mL待测液、6mL水、0.5mL福林-酚溶液，混匀，暗反应5min；1.5mL7%的Na2CO3溶液、1mL去离子水，加塞充分摇匀，室温暗处静置60min，在750nm处测吸光度。以没食子酸为标准品，以没食子酸浓度（0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.12、0.16mg/mL）为X轴，吸光度A为Y轴，绘制标准曲线。根据回归方程（Y=152.27X+0.0816，R2=0.998）计算提取液中多酚浓度，并按以下公式计算多酚含量。
1.3.3大孔树脂纯化
1.3.3.1大孔树脂的筛选
首先对树脂进行预处理，用90%乙醇对大孔树脂浸泡12h，装柱用蒸馏水冲洗到没有明显的乙醇气味，再倒入5%盐酸溶液处理12h，用蒸馏水冲洗，再用5%NaOH溶液处理12h，然后用蒸馏水洗到中性，储存备用。
将D101、D201、NKA、HP-20和X-55种经过预处理的大孔树脂进行真空抽滤以去掉多余水分，分别称取2g（W）抽干的树脂于50mL锥形瓶中，加入25mL（V1）火麻籽壳多酚粗提取液（C0），放入恒温振荡箱中室温振荡吸附24h，取1mL上清液测定火麻籽壳多酚质量浓度（C1）；用少许蒸馏水将充分吸附的各种树脂表面的残留粗提液冲洗干净，真空抽滤，去掉水分后，分别加入50%乙醇溶液25mL（V2）解吸24h，取1mL解吸液测定火麻籽壳多酚质量浓度（C）[18]。按照公式（2）～（5）计算吸附量（Q）、吸附率（A）、解吸率（P）、提取率（E），筛选出适合纯化火麻籽壳多酚的树脂。
1.3.3.2洗脱剂浓度对解吸的影响
将5种经过预处理的不同型号大孔树脂分别采用湿法装柱（2.5cm×60cm）后，沿内管壁加入待分离纯化的粗提取液15mL，分别加入30%、50%、70%、90%的乙醇15mL，在室温度下以1.0BV/h的流速进行洗脱，收集解吸液测定多酚含量，计算解吸率。
1.3.4抗氧化性测定
1.3.4.1DPPH自由基清除能力测定
配制不同浓度的多酚冻干粉溶液，分别量取0.3mL和2.7mL60μmol/LDPPH溶液混合摇匀，室温避光反应30min，518nm波长处测定吸光度，结果标记作As；取0.3mL蒸馏水和2.7mLDPPH溶液混合摇匀，测吸光度记作A0；取0.3mL不同浓度的样品溶液和2.7mL无水甲醇混合摇匀，测定吸光度记作Ar。用VC作为阳性对照。按照公式（6）计算多酚提取物对DPPH自由基的清除率[19]。
DPPH自由基清除率/%=[1-（As-Ar）/A0]×100（6）
1.3.4.2ABTS+自由基清除能力测定
配制不同浓度的多酚冻干粉溶液，分别量取0.3mL和2.7mLABTS工作液（7mmol/LABTS溶液和2.5mmol/L过硫酸钾溶液等体积混合，室温条件下避光反应12h～16h后，用80%的乙醇溶液进行稀释，使其在734nm波长处的吸光度为0.7）混合摇匀，室温避光反应30min，734nm波长处测定吸光度，结果标记作As；取0.3mL蒸馏水和2.7mLABTS工作液混合摇匀，测吸光度记作A0；取0.3mL不同浓度的样品溶液和2.7mL无水乙醇摇匀混合，测定吸光度记作Ar。用VC作为阳性对照。按照公式（7）计算多酚提取物对ABTS+自由基的清除率[19]。
ABTS+自由基清除率/%=[1-（As-Ar）/A0]×100（7）
1.4数据处理
试验数据均为3次重复试验结果的平均值，采用GraphPad Prism8.4.3软件进行作图，采用SPSS17.0软件进行差异性分析，P<0.05表示具有显著的统计学差异。
2结果与分析
2.1不同提取方法的多酚提取率
不同提取方法对多酚提取率的影响见图1。
不同字母代表具有显著性差异（P<0.05）。
图1 不同提取方法对多酚得率的影响
由图1可知，提取溶剂、提取温度、超声波辅助等均对火麻籽壳多酚的提取率有影响。以乙醇作溶剂的多酚提取率较水作溶剂的提取率高，其中，超声波辅助醇提法的提取率高于其他7种方法；相比于热回流醇提法和超声波辅助水提法，冷浸醇提法和索式醇提法多酚提取率偏高，但无显著差异；热回流水提法的多酚提取率最低，原因可能是温度过高，导致多酚类物质受热分解、含量下降；而超声波辅助醇提法与其他提取方法相比提取率最高且操作简便、可控制性强，故提取火麻籽壳多酚时，采取超声波辅助醇提取工艺。
2.2大孔树脂纯化
2.2.1大孔树脂的筛选
纯化火麻籽壳多酚的不同型号树脂的吸附率、解吸率、提取率如图2所示。
图2 不同树脂对多酚吸附率、解吸率及提取率的影响
由图2可知，对火麻籽壳多酚吸附率较高的是NKA、HP-20和X-53种树脂，其吸附率分别是74.5%、75.6%、74.5%；解吸率较高的是D201、X-5两种树脂，解吸率分别是50%、44.5%；提取率最高的是X-5树脂，为33.2%，因此选择X-5型号的树脂作为纯化火麻籽壳多酚的最佳树脂。
2.2.2乙醇浓度对多酚解吸率的影响
乙醇浓度对火麻籽壳多酚解吸率的影响如图3所示。
图3 乙醇浓度对多酚解吸率的影响
由图3可知，随着乙醇浓度的升高，多酚解吸率逐渐升高。植物多酚是有机物，其在水中的溶解度较小，当多酚溶解于乙醇时，不仅溶解度增大，而且乙醇中氧气溶解度较小，可以防止植物多酚被氧化而变质，因此选择90%乙醇解吸为宜。
2.3火麻籽壳多酚的抗氧化性分析
2.3.1纯化前火麻籽壳多酚对DPPH自由基的清除能力
以VC为阳性对照，8种不同提取工艺所得多酚样品对DPPH自由基的清除能力如表2所示。
表2 不同提取工艺纯化前火麻籽壳多酚对DPPH·的清除能力
注：同行不同字母代表具有显著性差异（P<0.05）。
由表2可知，在试验浓度范围内，不同样品对DPPH·具有清除能力，随着样品浓度的增大，不同提取方法的样品对DPPH·的清除率逐渐增大，在同一浓度水平时，VC较其余8种样品均表现出显著的DPPH·清除能力。有机溶剂冷提取法，即冷浸醇提法与超声波辅助醇提法所得样品对DPPH·清除能力更强，且显著高于除高温高压提取外的其余5种非有机溶剂冷提取法所得多酚样品，其中热回流醇提的多酚样品清除能力最弱，其热回流水提的多酚样品也较弱，原因可能是温度过高导致的清除能力降低。
2.3.2纯化前火麻籽壳多酚对ABTS+自由基的清除能力
VC、8种不同提取工艺下多酚对ABTS+·的清除能力如表3所示。
表3 不同提取工艺纯化前火麻籽壳多酚对ABTS+·的清除能力
注：同行不同的字母代表具有显著性差异（P<0.05）。
由表3可知，随着VC和样品浓度的升高，对ABTS+·的清除能力不断增强，不同样品对ABTS+·的清除率与样品浓度之间存在量效正相关关系；不同处理浓度下，对ABTS+·清除能力最强的是VC阳性对照，其次是超声波辅助醇提法所得样品（除120、160μg/mL）。对比8种不同提取方法，醇提取（UE、CE、HE、SE）工艺下所得多酚样品较水提取（UW、HW、CW、TW）工艺下所得多酚样品对ABTS+·的清除作用更强，且存在显著差异，可能原因是有机溶剂更有利于目标产物的萃取溶出[20]。
2.3.3纯化后火麻籽壳多酚对DPPH自由基的清除能力
VC、纯化前及纯化后超声波辅助乙醇法提取火麻籽壳多酚对DPPH·的清除能力如图4所示。
图4 不同样品对DPPH·的清除能力
由图4可知，在试验浓度范围内，随着样品浓度的增大，火麻籽壳多酚对DPPH·的清除率逐渐增大。纯化后的火麻籽壳多酚对DPPH·的清除能力高于纯化前火麻籽壳多酚，同时低于VC。说明经过试验纯化后，样品捕获DPPH·的能力增强，试验所选纯化条件可以富集多酚。
2.3.4纯化后火麻籽壳多酚对ABTS+·的清除能力
VC、纯化前以及纯化后火麻籽壳多酚对ABTS+·的清除能力如图5所示。
图5 不同样品对ABTS+·的清除能力
由图5可知，在试验浓度范围内，随着样品浓度的增大，火麻籽壳多酚对ABTS+·的清除率逐渐增大。纯化后的火麻籽壳多酚对ABTS+·的清除能力高于纯化前火麻籽壳多酚，且高于食品中常用的抗氧化剂VC，说明经过X-5型号大孔树脂纯化后，火麻籽壳多酚含量升高，清除ABTS+·能力增强。
3讨论与结论
通过超声波辅助（乙醇/蒸馏水）提取法、热回流（乙醇/蒸馏水）提取法、冷浸（乙醇/蒸馏水）提取法、索式抽提法、高温高压提取法8种不同方法提取火麻籽壳多酚，并对不同提取方法所得多酚粗提物样品进行抗氧化测定，结果显示，与蒸馏水相比，乙醇作提取溶剂时，多酚提取率明显提高；辅助超声波手段可以明显提高多酚提取率；因此，8种不同提取法中，超声波辅助乙醇提取法多酚提取率最高，可达2.34%；对比不同提取方法所得多酚粗提物的抗氧化活性可知，超声波辅助乙醇提取法所得样品在试验所选不同浓度水平上对DPPH和ABTS+自由基的清除能力均较强，因此，超声波辅助乙醇提取法可作为提取火麻籽壳多酚的最佳提取方法。采用大孔树脂对超声波辅助乙醇法所得多酚粗提物样品进行纯化，筛选得到纯化火麻籽壳多酚的最佳树脂为X-5，其吸附率和解吸率分别为74.5%和44.5%，乙醇解吸液浓度为90%。纯化后多酚对DPPH·和ABTS+·的清除能力与样品浓度之间存在量效关系，其IC50值分别0.38mg/mL和0.10mg/mL。本研究结果为火麻籽壳多酚的提取纯化工艺，以及火麻籽壳多酚在功能性食品添加剂以及医药领域的应用提供了一定的科学参考。
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