摘 要：本文采用差示扫描量热仪、低场核磁、原位拉曼光谱仪等手段研究不同酶解时间下亚麻籽粕蛋白酶解物对面团的冷冻保护作用。结果表明：酶解时间60min时，亚麻籽粕蛋白酶解物的热滞活性最高，为0.83℃，且此酶解时间下亚麻籽粕蛋白酶解物的冰重结晶抑制活性最显著，大冰晶比例降至最低。将亚麻籽粕蛋白酶解物添加到面团体系中发现水解度为13.62%（酶解60min）的酶解物冷冻保护效果最为显著，与对照组相比，面团中强结合水提高了13.2%，弱结合水、自由水分别降低了0.7%、7.9%；面团的最大发酵高度、最终高度、开始泄露CO2的时间分别提高了18.5%、24.4%、34.4%；蛋白结构分析表明，当水解度为13.62%时，面筋蛋白中α-螺旋相对含量最高，与对照组相比提高了35.3%，无规卷曲相对含量降低了28.9%；氨基酸侧链I760值提高了282.3%，I850/I830值降低了59.6%；二硫键g-g-g构型和g-g-t构型相对含量分别提高了8.8%、9.8%。综上，亚麻籽粕蛋白酶解物提升了面团的持水性能，缩短了面团的醒发时间，减弱了冰晶对面团网络结构的破坏，当水解度为13.62%时对面团冷冻保护作用最好。
关键词：蛋白酶解物；冷冻面团；热滞活性；分子结构；低温保护
有研究表明，面团在冷冻过程中会发生冰晶的生长和重结晶，进而导致面团关键组分的劣变[1]，具体表现为酵母活性和产气能力下降、面团持气能力减弱、淀粉结晶度增加、面团水分迁移，且最终面制品比容较小、硬度增加等问题[2-3]。目前，添加合适的抗冻剂是改善面团冷冻损害的最有效途径，其主要类型有海藻糖、复合磷酸盐、蔗糖酯、黄原胶、抗冻蛋白（肽）等[4]。但一些常规保护剂如糖类，多聚磷酸盐类等会使面团质量或其挥发性成分发生较大变化，安全性存在一定问题[5]。
经过大量研究表明，与鱼源、昆虫源、细菌源及真菌源的抗冻蛋白相比，植物源抗冻蛋白，冰晶重结晶抑制效果更佳[6]，可以很好地解决这一问题，而且其功能特性与任何毒性蛋白无关，具有较高的安全性。但在众多植物源抗冻蛋白不断被发现并被深入研究的同时，天然抗冻蛋白也面临许多的问题，如天然抗冻蛋白数量较少、安全性不高等[7-8]。因此，研究具有较高活性与安全性的食源性植物抗冻蛋白逐渐成为热点话题。
亚麻籽是我国重要的油料作物之一，将榨油后剩下的亚麻籽粕用来提取亚麻籽粕蛋白，得到粕的蛋白约占32%~49%，是非常好的蛋白资源[9]；且亚麻籽粕中含有较多的谷氨酸、精氨酸和天冬氨酸，通过对比几种植物类的食源性蛋白的氨基酸序列，亚麻籽粕蛋白在做抗冻剂方面具有较大的潜力[10]。国内外学者研究并报道了亚麻籽粕蛋白的许多功能特性，如抗氧化、抗菌性、抗高血压和降低胆固醇等[11-12]，但目前有关亚麻籽粕蛋白在做抗冻剂方面和对冷冻面团中关键组分的影响类文章研究较少。因此，本研究以亚麻籽粕为原料，探究亚麻籽粕蛋白及其酶解物在抗冻方面的功能特性以及对冷冻面团的低温保护作用，对亚麻籽资源的开发以及在食品中的应用提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料与试剂
材料：亚麻籽粕（蛋白质含量37.30%、含水量6.45%、含油率11.35%、灰分含量7.85%），河北省灵寿县信德农产品有限公司，外观整齐，无霉变；小麦精制粉（蛋白质含量11.1%，脂肪含量2%，含水量11.5%），河南金苑粮油有限公司；食用盐，郑州市盐业公司；活性干酵母，安琪酵母股份有限公司。
试剂：Alcalase碱性蛋白酶（酶活为3.9×105U/mL，经福林法测得），Sigma公司；氢氧化钠、盐酸（分析纯），天津市大茂化学试剂厂；其余未特别说明试剂均为国产分析纯。
1.2仪器与设备
HA-3480A 和面机，克莱美斯机电科技（深圳）有限公司产；LGL-50F 冷冻干燥机，北京松源华兴科技发展有限公司；DSC-Q2 差式量热扫描仪,美国 TA 公司产；mk200 冷热台，美国 INSTEC 公司；BX53M 偏光显微镜，日本 OLYMPUS 公司；HWS-080 恒温恒湿箱，上海精宏实验设备有限公司； BWS465-785S 便捷式拉曼光谱系统，美国 Bwbek 公司；F4 流变发酵仪，法国肖邦技术公司；NMI-20 低场核磁共振谱仪，上海纽迈电子科技有限公司；TA.XT plus 物性测定仪，英国 Stable Micro Systems公司。
1.3实验方法
1.3.1亚麻籽粕蛋白提取方法
将已脱油脱脂的亚麻籽饼粕超微粉碎、去除杂质、过80目筛。取一定量过筛的亚麻籽粕粉末溶解于去离子水中配制成质量分数为3%的悬浮液，保持温度35℃，调pH值至9.5，恒温水浴浸提4h。浸提结束，4℃、4500r/min离心30min，弃沉淀取上清。调上清液pH值至4.8，于4℃、4500r/min再次离心30min。取沉淀，纯水复溶，调pH值至中性。在4℃条件下透析除盐、冷冻干燥、密封保存。经上述方法提取后，亚麻籽粕蛋白含量为78.5g/100g，蛋白质的提取率为11.6%。
1.3.2酶解方法
根据张文敏[13]的方法略作修改，取一定量的亚麻籽粕蛋白干基配制质量分数为1%的悬浮液，恒温搅拌5min，pH调至8.5，加入6080U/g的Alcalase碱性蛋白酶，在45℃恒温水浴下，分别酶解0、30、60、90、120min，酶解结束后立即用沸水浴灭酶15min，透析除盐、冷冻干燥，留存备用。采用pH-stat法计算亚麻籽粕蛋白酶解物的水解度，计算公式如下：
式（1）
其中，V为水解过程中氢氧化钠的消耗量（mL）；Nb为氢氧化钠的浓度（mol/L）；α为亚麻籽粕蛋白的平均解离度，在50℃、pH8.5条件下α为0.955（无量纲）；Mp为底物中蛋白质的总量（g）；htot为底物中蛋白质的肽键总数，亚麻籽粕蛋白的htot为8.38（毫克当量/每克蛋白质）。
1.3.3热滞活性（THA）的测定
参照张艳杰[14]的方法并稍作修改，调整DSC温度变控速率为1℃/min，设置起始温度为10℃，首先降温至-20℃，停留5min至样品完全冻结，然后再以同样的速率升温至10℃，再降温至-20℃，记录样品熔点（Tm）和体系熔融焓（ΔHm）。继续以1℃/min升温至样品体系为固液混合物状态的某一温度（保留温度，Th），停留5min，再将温度从Th降低至-20℃，重复上述过程，记录不同Th下样品体系结晶的起始温度（T0）和结晶焓（ΔHf）。热滞活性（THA）和冰晶含量（Φ）的计算方法如式
（2）和式（3）：
式（2）中，THA为样品的热滞活性（℃）；Th为保留温度（℃）；T0为不同停留温度下样品体系
结晶的起始温度（℃）。式（3）中，Φ为样品中的冰晶含量（%）；ΔHf为保留温度停留后降温过程中体系的结晶焓（J/g）；ΔHm为样品的熔融焓（J/g）。
1.3.4冰重结晶抑制活性（IRI）的测定
参照Cao[15]的方法并稍作修改，步骤如下：取5μL样品溶液（5mg/ml，含10%蔗糖）滴于载玻片上，将载玻片置于冷台上，以20℃/min迅速将至-30℃，保持5min；以1℃/min升温至-14℃，保持5min；然后使样品在-14℃~-12℃之间循环5次，模拟样品在温度波动下的冰晶重结晶的环境，采集5次循环后冰晶形态图像（100×）。利用ImageJ图像分析软件统计图中冰晶的尺寸分布。
1.3.5面团的制备
准确称取300g面粉，加入面粉质量1%的酵母、1%的食盐、0.5%亚麻籽粕蛋白酶解物和45%的水，采用自动和面机和面10min。面团静置5min，然后进行反复冻融5次（一次冻融循环包括在-18℃下12h的冷冻过程和1h的解冻过程）。面团解冻在30℃、80%湿度的恒温恒湿箱中进行[16]。以不加亚麻籽粕蛋白酶解物的面团为对照。
1.3.6水分分布的测定
按照Zhang[17]的方法，采用低场核磁共振波谱仪测定面团中的水分分布。采用CPMG序列进行测量。实验参数为：回波个数（C0），1200；采样点数（TD），166446；扫描次数（NS），16；半回波时间（TE），0.208ms。
1.3.7发酵特性的测定
按照石媛媛[18]的方法并稍作修改，将解冻好的面团揉匀，利用F4流变发酵仪测定面团的发酵性能。测定条件为：面团重量，315g；醒发温度，37℃；醒发时间，3h；砝码重量，2kg。
1.3.8拉曼光谱采集
将解冻后的面团冷冻干燥、研磨过筛，参照张艳艳[19]的方法，称取0.8g过筛的面团粉末置于i-Ramanplus光纤探头下，并保证样品具有一定的厚度且表面平整。原位拉曼光谱仪在400~2000cm-1的波段范围内采集样品光谱。光谱采集参数：激发波长785nm，光谱分辨率为3cm-1，积分时间为10000ms，平行次数为3次；发射功率为总功率的50%。
1.3.8.1二级结构分析
对于酰胺Ⅰ带（1600~1700cm-1）中二级结构的分析，采用Peakfit软件对拉曼光谱进行基线校准、高斯去卷积和二阶导数等进行拟合峰，计算α-螺旋、β-折叠、β-转角以及无规则卷曲四种二级结构的相对含量。
1.3.8.2二硫键分析
对于二硫键（500~550cm-1）的分析，拉曼特征峰的结构可归属为：500~515cm-1处峰表示gauche-gauche-gauche（g-g-g）构型；515~535cm-1处峰表示gauche-gauche-trans（g-g-t）构型；535~550cm-1处峰表示trans-gauche-trans（t-g-t）构型。采用Peakfit软件对拉曼光谱进行基线校准、高斯去卷积和二阶导数等进行拟合峰，计算各二硫键构型的相对含量。
1.3.8.3氨基酸侧链分析
对于氨基酸侧链（820~860 cm-1 和 760 cm-1）的分析，利用 Origin 软件对原位拉曼光谱进行归一化、寻峰处理以及定性分析。
1.3.9数据处理与分析
用MicrosoftExcel2019对数据进行分析，用Origin和Peakfit软件进行作图，SPSS22.0软件进行显著检验（P＜0.05）。实验均重复6次，数据采用“平均值±标准差”表示。
2结果与分析
2.1酶解时间对亚麻籽粕蛋白酶解物热滞活性（THA）的影响
表1为不同酶解时间对亚麻籽粕蛋白酶解物THA的影响。结果表明，随着酶解时间的延长，热滞活性呈现先升高后降低的趋势，在酶解时间为60min时达到最大值0.83℃；有研究表明，抗冻蛋白的抗冻活性只存在于局部的多肽链片段[20]，并不是在整个蛋白质都发挥作用，亚麻籽粕蛋白经过适度酶解，具有抗冻活性的肽链结构域充分暴露或形成短肽，从而表现出较高的热滞活性[21]；但随着酶解时间延长，酶与底物的作用达到饱和可能会改变其周围的环境导致活性片段的分解与断裂，从而降低亚麻籽粕蛋白酶解物的热滞活性。综上，亚麻籽粕蛋白酶解物在做抗冻剂方面具有较大的潜力，这也为进一步考查其对面团的冷冻保护奠定了基础。
表1 不同酶解时间对亚麻籽粕蛋白酶解物热滞活性的影响
2.2酶解时间对亚麻籽粕蛋白酶解物冰重结晶抑制活性（IRI）的影响
图1显示了未添加和添加亚麻籽粕蛋白酶解物的蔗糖溶液经过5次温度循环（-14~-12℃）处理后的记录图像，由图1可以看出，对照组（蔗糖溶液）在冻结后形成的大冰晶（>30μm）数量较多。与对照组相比，添加亚麻籽粕蛋白酶解物的蔗糖溶液中大冰晶较少，且冰晶分布较为均匀，其原因可能是亚麻籽粕蛋白酶解物能够与冰晶体结合，抑制冰晶生长，降低冰点，使冰晶不能聚集增大[22]，在一定程度上起到抑制冰晶重结晶的效果。此外，我们采用ImageJ软件统计出每张图中冰晶的尺寸分布如图2所示，从图2中可以看出，相对于对照组，添加蛋白酶解物的样品中，大冰晶数量呈下降趋势，表明添加亚麻籽粕蛋白酶解物能够抑制冰晶的生长。
与0min（未酶解的亚麻籽粕蛋白）相比，经过酶解后的亚麻籽粕蛋白有显著的抑制效果，其中经过60min、120min酶解的亚麻籽粕蛋白形成的冰晶颗粒最为细小，分布致密且均匀，其抑制冰结晶的效果较其他组最为显著；此外，酶解30min时的亚麻籽粕蛋白酶解物也有较好地抑制冰晶重结晶的效果，这与汪少芸[23]等人的研究结果基本一致。结合亚麻籽粕蛋白酶解物的热滞和抑制冰重结晶能力，可得知对亚麻籽粕蛋白进行酶解能够在一定程度上细化冰晶，减小大冰晶的比例以及提高冰晶表面作用力，对延长冷冻食品的货架期，改善冷冻食品的品质具有重要作用。
图1 不同酶解时间下亚麻籽粕蛋白酶解物的IRI活性
图2 不同尺寸范围内的冰晶个数
2.3亚麻籽粕蛋白酶解物对冷冻面团水分分布的影响
亚麻籽粕蛋白酶解物对面团水分分布的影响规律如图 3 和表 2 所示。对照面团中 T21、T22 和 T23 组分的相对含量（A21、A22 和 A23）分别为 6.80%、91.80%和 1.40%，与对照面团相比，添加了亚麻籽粕蛋白酶解物的面团中 A21 显著提高，A22 显著降低，A23 在水解度为 0 时有所提高。根据表 2 可看出， 随着 DH 的增加，A21 呈现先增大后降低的趋势，在 DH 为 13.62%（酶解 60 min）时达到最大值，说明此时冷冻面团中强结合水含量最高，有效抑制了反复冻融引起的面团中水分迁移[24]，保证了面团中水分的稳定性；此外，DH 为 10.57%（酶解 30 min）的亚麻籽粕蛋白酶解物对面团水分状态也具有较好的保护作用；而 A22 呈下降趋势，表明嵌在面团内部结构中的弱结合水含量降低，转化成部分的强结合水和自由水，其原因可能是由于冷冻破坏了分子间氢键的相互作用，降低分子结构的规整性，增加了分子的无序度所致[25]。因此，在冷冻过程中添加一定量的亚麻籽粕蛋白酶解物可以对面团中水分 稳定性起到较好的冷冻保护作用。而稳定的水分状态、均匀的水分分布更有益于面团发酵，得到比容 大、质地松软有弹性的发酵面食[26]。
图3 面团横向弛豫时间（T2）分布曲线
表2 亚麻籽粕蛋白酶解物对面团水分分布的影响
2.4亚麻籽粕蛋白酶解物对冷冻面团发酵特性的影响
由表3可知，在反复冻融5次后，与对照组相比，随着DH的增加，面团的Hm、h均大于对照组，在DH为13.62%（酶解60min）时两者均达到最大值（Hm=42.2mm，h=34.0mm）；Hm和h可以综合体现面团在发酵过程中的产气和持气能力[24]，因此这些都可以有效证明向面团中添加亚麻籽粕蛋白酶解物可以有效地减弱冷冻过程对酵母和面筋蛋白体系的破坏作用，从而缩短面团的醒发时间，提高酵母的产气能力和面团的持气能力[27]；另一方面，随着酶解时间的延长，Tx逐渐延后，较大的Tx值在一定程度上可反映面团的筋力，故在DH为13.62%时Tx达到最大值，此时面团的筋力最好，可以有效减缓冷冻对面筋蛋白网络的破坏，提高酵母细胞的存活率，从而更好地提升了面制品的感官品质；Vt和Vr值也显著高于对照面团，这也充分表明了添加适量的亚麻籽粕蛋白酶解物有助于保护酵母细胞和面筋网络结构免受冰晶的破坏，对冷冻面团起到了一定的保护作用[28]。综上，添加亚麻籽粕蛋白酶解物可以提高酵母产气和持气能力，提升冷冻面制品的最终品质，使面团及其制品更加松软。
表3 亚麻籽粕蛋白酶解物对面团发酵特性的影响
2.5亚麻籽粕蛋白酶解物对面团中面筋蛋白分子结构的影响
拉曼光谱常用来表征蛋白分子结构的变化，其中500~550cm-1、760cm-1与820~860cm-1和1600~1700cm-1分别与面筋蛋白中二硫键、色氨酸、酪氨酸以及酰胺Ι带相关，因此这些光谱峰常用来分析蛋白分子结构（二硫键构型、氨基酸侧链和二级结构）的变化[29]。
2.5.1二级结构分析
亚麻籽粕蛋白酶解物对面团中面筋蛋白二级结构的影响如图4所示。与对照组相比，添加亚麻子粕蛋白酶解物后，面团中面筋蛋白的α-螺旋结构的相对含量呈现先增加后减少的趋势，β-折叠结构和无规卷曲结构的相对含量先减少后增加，β-转角结构的相对含量在DH为15.24%达到最大值，在DH为0时最小。当DH为13.62%（酶解60min）时，面团中面筋蛋白的α-螺旋结构占比达到最大，无规卷曲和β-折叠结构相对占比最少，表明蛋白分子结构向相对有序化（α-螺旋结构）转变。其次，面团在反复冻融过程中，由于二硫键的断裂，面筋蛋白中会形成一些新的小分子物质，这些小分子物质在化学键的作用下会发生聚集现象，从而会使β-折叠结构的相对含量升高，而在DH为0~13.62%时，相对于对照组，β-折叠结构的相对含量呈显著下降趋势，表明在此水解度的范围内酶解物的添加可以减少这种聚集现象[30]。
结果表明了添加一定水解度的亚麻籽粕蛋白酶解物对面团中面筋蛋白在冷冻过程中结构的破坏具有抑制作用，而这种作用可能是酶解物的添加抑制了冷冻过程中冰晶生长、降低了冷冻对蛋白结构的机械破坏产生的。本研究中DH为13.62%时，其对面筋蛋白的冷冻保护作用最显著，DH更高反而其冷冻保护作用下降，这可能是因为亚麻籽粕蛋白酶解物的DH较高时，引入了较多不利于面筋蛋白结构稳定的短肽和氨基酸[28]。
图4 亚麻籽粕蛋白酶解物对面团中二级结构的影响
2.5.2二硫键分析
二硫键在面团中的含量会影响面筋蛋白网络结构的形成和最终面制品的品质[29]。亚麻籽粕蛋白酶解物对面团中二硫键的影响如图5所示，与对照组相比，随着亚麻籽粕蛋白酶解物DH的增大，二硫键中g-g-g构型的相对含量先增加后降低，t-g-t构型含量先降低后增加，g-g-t构型相对含量在DH为13.62%（酶解60min）时达到最高。通过以上分析我们发现，面团在反复冻融过程中，添加一定DH的亚麻籽粕蛋白酶解物可以使二硫键中不稳定的t-g-t构型转化为较稳定的g-g-g构型，在一定程度上抑制了冻融循环对面筋蛋白结构的破坏，维持了面筋蛋白网络状结构的稳定性，当DH为13.62%时这种抑制作用效果最佳，DH为10.57%（酶解30min）的亚麻籽粕蛋白酶解物也对面筋蛋白二硫键具有冷冻保护作用，而这种保护作用是由于亚麻籽粕蛋白酶解物具有抗冻活性，可以抑制冷冻过程中冰晶的生长和重结晶[31]，从而降低冰晶对面筋蛋白结构的破坏。
图5 亚麻籽粕蛋白酶解物对面团中二硫键的影响
2.5.3氨基酸侧链分析
亚麻籽粕蛋白酶解物对面团中氨基酸侧链的影响如图6所示。通过分析氨基酸残基在其对应波数范围附近吸收强度变化可以得到其三级结构的变化[32]。添加亚麻籽粕蛋白酶解物有效地抑制了色氨酸（I760）的暴露程度，并有助于减缓冰晶对面团中氢键的破坏作用，使酪氨酸残基（I850/I830）更好地处于“包埋”的环境中。氨基酸侧链结果表明了添加一定DH的亚麻籽粕蛋白酶解物可以有效抑制冻融循环对面筋蛋白三级结构的破坏[33]，对面团在冷冻过程中起到了一定的保护作用，且这种保护作用在DH为13.62%（酶解时间为60min）时效果最佳。
图6 亚麻籽粕蛋白酶解物对面团中氨基酸侧链的影响
3结论
本文系统地阐述了亚麻籽粕蛋白酶解物的抗冻性能以及对面团的冷冻保护机制。在酶解60min时，亚麻籽粕蛋白酶解物的热滞活性最高，冰重结晶抑制活性最为显著；将酶解物添加到面团体系中发现，不仅提升了面团的持水性能，而且缩短了面团的醒发时间，同时酶解物的添加在一定程度上减弱了冰晶对面团网络结构的破坏，使蛋白二级结构趋向有序化。综上所述，亚麻籽粕蛋白酶解物的添加对面团在冻融循环过程中具有显著的保护作用，为冷冻面团的品质的改良和植物源蛋白的开发提供了理论参考。
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文章摘自：张艳艳,郭朋磊,卢晔,黄圆圆,刘兴丽,张华.亚麻籽粕蛋白酶解物对面团的低温保护作用[J/OL].食品科学:1-12[2022-08-04].
