摘 要：为提高大麻育种效率，本文对诱导大麻雌株形成的物理化学方法、环境因素等及全雌种子产生的方法进行概述，并提出未来利用现代分子生物学技术对大麻进行雌化的可能途径。一方面是建立大麻植株性别早期鉴选技术，从而提高栽培效率并缩短育种进程；另一方面可通过分子设计育种来达到雌化目标，即建立稳定高效的大麻遗传转化体系和克隆大麻调控雌性分化的重要功能基因。
关键词：大麻；雌化；全雌种子；大麻素；处理方法
大麻又称寒麻、火麻和魁麻等，是大麻科大麻属植物。大麻的种植起源于中亚，而后进入东亚、南亚和欧洲，进而贯穿非洲和美洲大陆[1]。大麻多为雌雄异株，在大田里，雌雄株比例接近1∶1，或比值小于1[2]。大麻雌株高大，叶片多，茎秆木质化晚；而雄株叶片较少，茎秆细，开花以后很快木质化。大麻的各个部位在生产上有许多用途[3]，可分为工业大麻和药用大麻，其本质区别是工业大麻中具有致幻作用的四氢大麻酚（THC）含量低于0.3%。大麻茎秆中的纤维质量精良多用于纺织麻布、制绳子、造纸等[4]；种子可榨油作为油漆、涂料来使用；大麻仁可治疗多种疾病，也是保健食品的良好原料[5]。大麻中的大麻素多集中在雌性植株表面的毛状体，大麻酚类多存在于雌花未结籽之前的花序及花序附近的叶片。最常见的大麻素为大麻二酚（CBD）和四氢大麻酚（THC），大麻二酚可消除四氢大麻酚对人体产生的致幻作用，并对抑郁症和儿童癫痫有较好的疗效，在医药领域有较高的商业价值。
在大麻制种时，雄株产生花粉量大并且散粉时期长，雌株数量对制种效率起决定作用。因此，在田间种植面积一定的情况下，雌株数量增多可以有效增加繁殖倍数，提高经济效益。在利用大麻生产大麻二酚时，由于大麻素主要分布在雌株花萼等处的腺毛中，雌性植株所占比例直接影响大麻二酚产量，因此提高群体中雌株比例非常重要[6]，而大麻雌化是促使雌花增多或诱导形成雌雄同株进而获得全雌种子的方法。近年来，利用化学、物理及栽培管理等方法进行大麻雌化的研究正在开展，但所取得的成果应用很少。本文对目前已发表的大麻雌化的方法进行了整理，并提出未来利用现代分子生物学技术获得雌化的可能方法，以期为大麻的实际生产及科学研究提供一定的理论参考。
1诱导雌株形成
植物性别的决定是基于遗传因素，而其性别的表达则依赖基因型和环境因素。目前可采用重金属盐、化学诱变剂、激素及激素抑制剂处理大麻使其雌花增多，雄花减少，增加雌株占比，在大麻种植管理方面，可以对光周期、温度和肥料等方面进行调控。
1.1物理化学诱变
1.1.1重金属盐（HM盐）
大麻植物体内激素平衡可被外界因素影响，从而决定性别表达[7]。Soldatova等[7]用重金属盐对不同熟期大麻品种的种子进行处理后可引起激素水平变化，进而影响性别表达。结果表明，与对照相比，施用CuSO4和ZnSO4后，早熟和晚熟品种的大麻雄花与雌花的比例显著降低，雌花数量增加，雄花数量减少25.3%～28.4%；中、晚熟品种GA含量分别降低47.1%和50.5%，早熟品种GA含量在ZnSO4处理后显著降低，而CuSO4处理变化不明显。个体发育过程中性别分化和表达主要依赖于植物激素，其可在不同水平上调控蛋白质的合成、酶活性、呼吸速率、细胞分裂、生长和分化等[7]。由于3对真叶期是茎尖端生长点从营养生长向生殖生长过渡的关键阶段，此时植物内源激素含量对于大麻的性别决定至关重要。HM盐可通过影响大麻3对真叶期植物激素的平衡来调控性别表达。铜盐和锌盐的施用使植株中赤霉素含量显著减少，玉米素含量增加，从而导致植株变矮，雌花分化，但铜和锌是如何调控激素含量变化的机理还需要进一步研究。HM盐处理晚熟品种时，由于其营养生长和生殖生长过程较长，使得HM盐在调控植物激素平衡状态中发挥更长、更稳定的作用，从而对植物性表达影响更强。此外，在野牛草、黄瓜、西洋山靛、大麻的根及叶片的研究结果都表明，赤霉素可诱导植物雄性化，细胞分裂素可诱导植物雌性化[8，9，10，11，12]。
1.1.2激素诱导
Chailakhyan[13]早在1937年就提出，性激素调控植物从营养生长到开花的转变。据Herich[14]的研究，大麻种子浸泡在赤霉素中24h可以诱导更多的大麻雌株。房郁妍[15]发现6-BA、3AA、IAA处理后可使大麻产生雌花且雌株比例均在70%以上。而乙烯利作为乙烯来源之一，也可通过调控植物内源生长素水平来影响性别表达，研究表明，乙烯处理可使大麻雄株上诱导出雌花[16，17]。Ram等[18]人也进行了乙烯利对大麻雌化的研究，采用低、中、高三种浓度的乙烯利对大麻幼苗进行处理。结果表明，乙烯利处理对大麻花器官发育及性别分化有较大影响，低浓度乙烯利处理的植株仅结有少数雌雄间花（代表了正常雄花向雌花转变的阶段）、雄蕊数目减少的花，没有雌花形成；中等浓度乙烯利处理的植株出现雌花、雌雄间花的节数较多，雄花的雄蕊数减少，且所有这些类型的花都可出现在同一簇中；而高浓度乙烯利处理植株雌化程度增强，但花的总数大幅度减少。这些数据表明，乙烯利处理大麻雄株可以改变花的性别表达，诱导雌花产生。此外，乙烯利处理也对大麻植株叶片发育和株高有影响，且浓度越高影响效果越明显，但在处理10d后症状消失；同时乙烯利处理还会使大麻节间变短，但节数不变。
形态素（Morphactin），又称整形素，在农业上应用广泛，是一种暂时性的生长素运输抑制剂，被茎叶吸收后可通过韧皮部和木质部上下传导运输。形态素对大麻雌性植株处理没影响，但可对雄性植株产生影响。Ram等[19]选用不同浓度形态素MorphactinIT3456[甲基-2-氯-9-羟基芴-（9）-羧酸盐]分别对大麻雄株叶片进行处理。结果发现，低浓度形态素处理21d后植株上开始出现雌花；经中等和高等浓度形态素处理的植株开花延迟14d，新花表现为花部皱缩和不同程度的雌性化。当处理42d后，施用低等或中等浓度形态素的植株恢复正常生长，并分化出雄花；而施用高浓度形态素的植株花仍然发育不良，只形成异常花。可见，中高浓度形态素处理可导致极端雌性化，但形态素的作用机理还不确定。
1.1.3其他方法
有些化学诱变剂处理可起到雌化作用，用N-二硝基甲基脲处理雌雄异株的大麻种子，M1代雄株减少5%～7%；用硫酸二甲脲处理则减少1%～5%；当用0.015%的N-二硝基甲基脲处理雌雄同株的种子，则雄株完全消失；秋水仙碱对大麻性比例变化产生更实质的影响，增加雌株的比例，且产生的影响可传递给后代[20]。另外，利用物理方法伽马射线处理雌雄同株和雌雄异株的大麻种子，由于雌性种子对射线不敏感，而雄性种子因耐放射性能力低而导致雄株减少，从而增加雌株的比例，也可达到雌化的目的[20]。
1.2环境因素
大麻是短日植物，在夏季播种，由于日照时间长，群体中的雌雄株正常生长，雌雄比例变化不大，但若在日照时间较短的秋季播种，就会有50%～90%雄株转为雌株[21]。也有研究表明，大麻若在12月进行温室内播种，则有50%～90%的雌株转为雄株，以至最后全变为雄株[22]。辛培尧等[23]认为冬季自然短日照可以使大麻性别发生逆转，可能是雄性变雌性，也可能是雌性变雄性；而人工短日照处理并不会使大麻性别发生逆转。同样是适宜大麻性别分化的短日照条件，却在自然条件和温室状态下表现出不同的结果，究其原因，可能是大麻性别分化是生长环境中光周期和温度协同作用的结果。自然条件中光周期和温度变化较大，温室中光周期和温度基本无变化，而在适宜的光周期下，低温和较大的昼夜温差都会促进雌花分化。
另外，在田间生产管理时，氮肥增加有利于雌花分化。Werf等[24]研究表明，大麻生长期间，随氮肥施用量增加，雌株比例显著增加。当使用8倍于克氏溶液的氮肥时，可得到100%的雌株[25]。但是，氮肥会抑制大麻生殖生长，采用高浓度氮肥诱导雌株的方法用于生产依然不可取。
1.3其他因素
还有一些研究表明大麻花和叶片酶活性及蛋白质含量与植物性别分化相关。强晓霞[26]研究发现，成熟期大麻雌株的花和叶片中过氧化物酶（POD）活性和可溶性蛋白质含量均显著高于雄株。在苦瓜上也得到类似的结论，张玲玲[27]在全雌系、强雌系和弱雌系3种性型苦瓜上的研究表明，POD活性与雌性呈正相关；汪俏梅等[28]对苦瓜雌花、雄花的可溶性蛋白质进行分析，发现了一些与性别分化有关的特异蛋白质，推测一个11kD的蛋白质可能是雌花分化程序表达中的一种“关键蛋白”。可见，高POD活性及高可溶性蛋白质含量均与植株雌性分化正相关，这也可能成为未来大麻雌化方法建立的一个方向。
2诱导全雌种子形成
雌雄异株大麻制种时工作量大，成本高，效率低，且后代植株雌雄各半。使用乙烯拮抗剂硫代硫酸银（STS）、乙烯合成抑制剂氨基氧乙酸（AOA）和银离子可诱导大麻雌株产生雄花而变为雌雄同株，从而获得全雌性种子，可为大麻中酚类物质（如CBD）的提取提供优异种质资源。
硫代硫酸银（STS）是效果显著的乙烯拮抗剂，因其制备简单，在花卉保鲜上被广泛使用。近年来，STS在大麻上被用来制作全雌种子。陈璇等[29]用自制STS诱导大麻雌株变为雌雄同株，完成自由传粉，再将得到的种子种植并二次诱导后，无需去雄即可获得纯雌性工业大麻种子。此方法基于工业大麻为雌雄异株的现状，用化学诱导的方法对其特定的生长时期处理，进而得到纯雌性工业大麻种子，成本低，操作简便，对于简化工业大麻杂交制种过程及纯化方法方面有较好应用前景。但要注意银离子是重金属，使用后的废液要集中处理避免对环境造成污染。
氨基氧乙酸（AOA）常用来处理鲜切花，延长插花寿命，还用来抑制植物的偏上性生长，AOA能阻断植物合成乙烯。AOA本身并不稳定，通常都是与酸生成氨基氧乙酸盐后进行保存。董晓慧等[30]采用异亚丙基氨基氧乙酸和挥发性酸反应生成的混合物来诱导纯雌性工业大麻。此方法可减少去雄过程中的人工劳动时间，且对水和环境的污染也大大降低，获得大麻纯雌性种子效率提升，适合市场推广。
李骏等[31]使用纳米银胶体喷雾处理工业大麻雌株诱导其转换为雌雄同株，分化出雄花，经自由授粉，结籽得到全雌性工业大麻种子，纯度可达到96%以上。所需胶体银溶液量较少，诱导成本降低、程序简化，诱导雌化成功率高且稳定。
3展望
目前，对大麻性别诱导的研究主要在环境和化学试剂等方面，但可能由于其他因素的干扰，性别转化的结果不稳定[32]。本文介绍的大麻雌化方法中，化学试剂诱导可能会对环境造成污染并对人体产生伤害；物理方法可能见效不明显，还会受自然环境因素影响使得效果不稳定。到目前为止，受大麻种植法律法规的影响，研究者们几乎全是针对工业大麻进行雌化，而对药用大麻的雌化研究未见报道。建议以获取大麻药用成分为目标的生产时，针对药用大麻进行雌化试验，可在降低成本的同时，大大增加花叶的产量。
未来随着遗传学和分子生物学领域方法和技术的快速发展，可采用现代分子生物学技术在大麻早期性别鉴定及分子设计育种等方面开展相关研究，来实现大麻雌化的目的。参考其他作物，未来在大麻雌化方面可能采取的措施主要有两方面。一方面是，建立大麻性别早期鉴选技术，可从生理生化、细胞组织学和分子标记等方面入手，力求从不同程度和不同水平上，在幼苗期就能鉴别出植株个体的性别，从而提高栽培效率并缩短育种进程。近年来，应用分子标记技术辅助育种已经在各类作物中广泛应用。而用于植物性别分化研究的分子标记主要是随机扩增多态性DNA（RAPD）和限制性片段多态性DNA（RFLP）技术。RAPD因不需要放射性同位素标记，且所需样品量少等特点而成为常用标记。目前大多数利用RAPD技术所使用的标记大部分是雄性特异性的，可参考使用大麻近缘种的RAPD标记在苗期鉴选出雄性植株，反向来达到雌化的效果。也可针对雌雄同株大麻进行研究来获得与雌雄同株密切相关的分子标记。
另一方面，可通过分子设计育种来达到雌化目标，可采取将正调控雄性分化重要基因进行基因编辑或RNA干扰技术来达到基因敲降，或使正调控雌性分化关键基因过量表达等方式；也可对一些酶（如POD）、雌性分化的特异关键蛋白、激素（主要是乙烯和细胞分裂素）合成关键酶进行分子设计育种来提高大麻雌化。
但是，分子设计育种的前提是必须要建立稳定高效的大麻遗传转化体系和克隆大麻调控雌性分化的重要功能基因，目前这两方面研究还尚处于起步阶段，均未达到要求。相信在未来的研究中，随着分子技术的快速发展，在国家和各级政府的大力支持下，大麻科研工作者会早日突破大麻性别分化的“瓶颈”，为农业、工业、军需、航空及医药等领域提供更多优质的大麻原材料。
文章摘自：牛庭莉,张树权,韩喜财,牛江帅,吴荣,程欣然,戴凌燕.大麻雌化处理方法的研究进展[J].黑龙江农业科学,2022(01)：100-104.
