作者：昝珂等   来源：   发布时间：2021-11-03   Tag:   点击：
[麻进展]罗布麻叶中肝毒性成分吡咯里西啶生物碱的含量分析及其初步风险评估
摘 要：目的：对罗布麻叶中吡咯里西啶生物碱的含量进行测定，并根据测定结果进行肝毒性初步风险评估。方法：样品经过Qu ECh ERS法提取后，采用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）法测定印美定、石松胺、印美定氮氧化物和石松胺氮氧化物的含量。结果：6批罗布麻叶样品中印美定、石松胺、印美定氮氧化物和石松胺氮氧化物的含量范围分别为10.51～27.56、20.66～42.54、40.54～76.89和61.45～164.23μg·kg-1。含量超过一些国家或组织的规定，长期使用存在一定的安全风险。结论：本研究所建立的方法为罗布麻叶中肝毒性成分吡咯里西啶生物碱的质量控制和安全性评价提供了科学依据。
关键词：罗布麻叶；肝毒性成分；吡咯里西啶生物碱；超高效液相色谱-串联质谱；含量测定；风险评估
 

罗布麻叶为夹竹桃科植物罗布麻Apocynum venetum L.干燥叶，具有平肝安神、清热利水的功效，用于肝阳眩晕、心悸失眠、浮肿尿少等疾病的治疗，分布于我国新疆、青海、甘肃、陕西、山西、河南、河北、江苏、山东、辽宁及内蒙古等省区[1,2]。现有罗布麻茶、罗布麻片、罗布麻胶囊等中成药使用罗布麻叶作为处方药材。罗布麻叶还被国家卫生健康委员会列入可用于保健食品的中药材之一[3]。罗布麻叶主要含有黄酮、酚酸、生物碱等多类化合物[4]。吡咯里西啶生物碱（Pyrrolizidine Alkaloids,PAs）广泛存在于菊科、紫草科、豆科、夹竹桃科等植物中，吡咯啶环的1,2位为双键的PAs成分，具有较强肝毒性，过量或长期摄入可引起不可逆的肝损伤，严重的可造成肝硬化和肝纤维化等不良后果[5,6,7,8]。Wang等[9]建立超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）法从罗布麻叶中鉴定出石松胺及其氮氧化物和印美定氮氧化物等肝毒性PAs成分并测定了含量。PAs成分在罗布麻叶中属于痕量水平，供试品需采用固相萃取（Solid Phase Extraction,SPE）或QuEChERS(Quick,Easy,Cheap,Effective,Rugged,Safe）法进行净化处理。采用SPE前处理操作较为复杂，整个过程需要2～5 h。QuEChERS是近年来国际上最新发展起来的一种用于农产品检测的快速样品前处理技术，原理与SPE相似，都是利用吸附剂填料与基质中的杂质相互作用，吸附杂质从而达到除杂净化的目的[10]。采用QuEChERS进行样品前处理较为简便快捷，整个操作过程仅需约30 min，大大提高了检测效率。目前QuEChERS结合液质联用法检测中药材中PAs已经有报道[11,12,13]，如Martinello等建立QuEChERS法结合液质联用技术测定了蜂蜜中9个PAs的含量。印美定、石松胺、印美定氮氧化物和石松胺氮氧化物均为1,2位不饱和的PAs（结构式见图1），该类生物碱具有较强的肝毒性[8]，是罗布麻叶中含量较高的4个PAs类成分。PAs在药材中一般为微量成分，紫外吸收不强，常规的液相色谱法往往难以检测，液质联用法是PAs类成分测定的首选。本文建立超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）法测定罗布麻叶中印美定、石松胺、印美定氮氧化物和石松胺氮氧化物4个PAs含量，并根据测定结果进行初步的风险评估。罗布麻叶中存在印美定为首次发现并报道其含量。

 

 
图1 印美定（1）、石松胺（2）、印美定氮氧化物（3）和石松胺氮氧化物（4）的结构式
1 仪器与材料
Waters AcquityTM UPLC色谱仪（Waters公司）；Waters Xevo TQ-S三重四极杆串联质谱检测器（Waters公司）；KQ-500DE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；XS105DU十万分之一电子分析天平（METTLER TOLEDO公司）；Milli-Q超纯水系统（Millipore公司）。
对照品：印美定（批号13420）、石松胺（批号12183）、印美定氮氧化物（批号13418）和石松胺氮氧化物（批号13484），均购于Phyto Lab GmbH公司。萃取盐包（含硫酸镁4 g、氯化钠1g、柠檬酸三钠1g和半水柠檬酸氢二钠0.5g,Agilent公司，部件号5982-5650CH），净化包[含乙二胺-N-丙基硅烷（PSA)150 mg和硫酸镁900mg,Agilent公司，部件号5982-5056]。乙腈、甲醇、甲酸和甲酸铵均为质谱级（Fisher公司），水为超纯水。
罗布麻叶样品共6批（编号分别标记为S1～S6），分别采自江苏省、山东省等地，经中国食品药品检定研究院中药民族药检定所金红宇主任药师鉴定为夹竹桃科植物罗布麻Apocynum venetumL.干燥叶。
2方法与结果
2.1溶液的制备
2.1.1混合对照品溶液
精密称取印美定、石松胺、印美定氮氧化物和石松胺氮氧化物的对照品适量，分别以10%乙腈水配成质量浓度分别为0.988、1.012、0.976和1.016μg·mL-1的单一对照品储备液。分别精密称取各单一对照品储备液适量，用10%乙腈水配成质量浓度分别为9.88、10.12、9.76和10.16 ng·mL-1的混合溶液，即得。
2.1.2供试品溶液
取罗布麻叶粉末（过四号筛）2.0g，置50 mL离心管中，加10 mL0.1%磷酸水溶液，涡旋混匀，加入10 mL乙腈，加入萃取盐包，涡旋1min后，8000r·min-1离心5 min，精密吸取上清液10mL，置15mL离心管中，加入净化包，涡旋1min后，8000r·min-1离心5min，取上清液5mL,40℃以下氮气吹干，用10%乙腈水溶液溶解转移至5mL量瓶中，定容至刻度，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得。
2.2色谱-质谱条件
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（100 mm×2.1 mm,1.8μm）；柱温：40℃；流动相：0.05%甲酸和2.5 mmol·L-1甲酸铵的水溶液（A）及含0.05%甲酸和2.5mmol·L-1甲酸铵的乙腈（B），梯度洗脱（0～8min,3%→10%B;8～20 min,10%B）；流速：0.3 mL·min-1；进样量：1μL；质谱离子源为电喷雾离子化源（ESI），正离子，多反应监测模式（MRM），毛细管电压3.0kV，离子源温度150℃，去溶剂温度500℃。4个PAs的质谱条件见表1，对照品及样品的色谱图见图2。
表1目标成分的MS参数
 
图2混合对照品（A）和S1号样品（B）的MRM色谱图
 
1.印美定；2.石松胺；3.印美定氮氧化物；4.石松胺氮氧化物。
2.3方法学考察
2.3.1线性关系、检测下限、定量下限考察
精密吸取各对照品储备液0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 mL，一一对应分别置于6个10mL量瓶中，加10%乙腈水定容至刻度，摇匀，即得各系列浓度的混合对照品溶液，用0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，按照“2.2”项条件进样测定。以对照品的峰面积Y为纵坐标，对应的浓度X为横坐标，进行线性回归。以定量离子的色谱峰信噪比S/N≥3对应的最低浓度为检测下限（LLOD），以定量离子的色谱峰信噪比S/N≥10对应的最低浓度为定量下限（LLOQ），结果见表2。
表2线性方程、线性范围、检测下限和定量下限
   

2.3.2精密度试验

精密吸取“2.1.1”项的混合对照品溶液1μL，连续进样6次，记录峰面积。结果印美定、石松胺、印美定氮氧化物和石松胺氮氧化物的平均峰面积（n=6）分别为204126、317767、81785和184607,RSD分别为2.6%、2.8%、2.4%和2.1%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 稳定性试验

取同一份供试品溶液（S1号样品），分别于0、2、4、8、12、24 h进样测定。结果印美定、石松胺、印美定氮氧化物和石松胺氮氧化物峰面积的RSD(n=6）分别为1.8%、2.2%、2.4%和2.5%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.4重复性试验

按照“2.1.2”项下方法制备S1号样品的供试品溶液6份，分别进样测定。结果印美定、石松胺、印美定氮氧化物和石松胺氮氧化物的平均含量分别为10.51、20.66、49.45和105.66μg·kg-1,RSD分别为3.8%、3.3%、3.5%和3.1%，表明该方法的重复性良好。

2.3.5加样回收试验

分别精密量取“2.1.1”项下印美定、石松胺、印美定氮氧化物和石松胺氮氧化物的单一对照品储备液适量，分别加10%乙腈水配制成上述4个成分质量浓度依次为9.88、20.24、48.80和101.6ng·mL-1的各单一对照品溶液。取已知含量的S1号样品的粉末6份，每份各约1.0g，精密称定，分别置50mL离心管中，精密加入上述4个单一对照品溶液各1.0mL，再加入6mL0.1%磷酸水溶液，涡旋混匀，加入10mL乙腈，加入萃取盐包，按照“2.1.2”项方法平行制备供试溶液，进样分析，计算回收率。结果印美定、石松胺、印美定氮氧化物和石松胺氮氧化物平均加样回收率（n=6）分别为92.1%、88.2%、84.3%和93.4%,RSD分别为4.5%、4.1%、3.5%和3.3%。

2.4含量测定

准确称取不同产地的罗布麻叶药材2.0g，分别按照“2.1.2”项方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样测定，依据外标法计算印美定、石松胺、印美定氮氧化物和石松胺氮氧化物的含量，结果见表3。

3风险评估

所测6批罗布麻叶样品中4个PAs的含量总和为149.73～287.01μg·kg-1。现行标准[1]规定罗布麻叶用量为6～12g，因此，每日摄入量最低为0.90μg，最高为3.44μg。目前世界各国权威机构根据毒理学研究结果出台了一系列规定[14,15]（见表4），虽然规定不完全一致，但都十分严格。罗布麻叶是可用于保健食品原料的中药材，我国暂未发布过食品和药品中PAs的限量规定。但参照表4中其他各国家或组织对PAs的规定，罗布麻叶中PAs的含量大多超过限量范围，长期使用可能存在一定的安全风险。

表3样品含量测定结果（其中S1：n=6；S2～S6：n=2）

 

表4不同国家或组织对PAs含量的规定

 

 

4讨论

4.1检测方法的选择

印美定、石松胺、印美定氮氧化物和石松胺氮氧化物等为罗布麻叶中最主要的PAs类成分，为痕量组分，高灵敏度的UPLC-MS/MS法检测为首选方法。本试验采用UPLC-MS/MS法同时测定正离子模式下4个成分的MRM离子对，定量离子峰形好，其他物质无干扰，能够对待测物质准确测定。

4.2流动相的选择

由于所测4个化合物中为2组非对映异构体（组1：印美定和石松胺；组2：印美定氮氧化物和石松胺氮氧化物），非对映异构体的分子离子峰和质谱裂解行为基本一致，需要通过色谱柱将其分开，通过调节梯度比例，在15min内这2组非对映异构体均达到基线分离，最终确定流动相为含0.05%甲酸和2.5mmol·L-1甲酸铵的水溶液及含0.05%甲酸和2.5mmol·L-1甲酸铵的乙腈，梯度洗脱；在该系统下4个成分得到较好的保留和分离。

4.3小结

本文采用建立的UPLC-MS/MS法可同时测定罗布麻叶中4个主要PAs的含量，方法简便、准确且重复性好。6个批次的罗布麻叶中4个PAs的含量测定结果表明印美定、石松胺、印美定氮氧化物和石松胺氮氧化物的含量范围分别为10.51～27.56、20.66～42.54、40.54～76.89和61.45～164.23μg·kg-1。风险评估提示可能存在一定的用药安全风险，应对该药肝毒性进行深入研究，进一步保障人民用药安全。

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文献摘自：昝珂,周颖,李耀磊,左甜甜,金红宇,王莹,马双成.罗布麻叶中肝毒性成分吡咯里西啶生物碱的含量分析及其初步风险评估[J].中国药事,2021,35(07):757-762.


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